同时检测淡水鱼加工中土霉素和微囊藻毒素(MC-LR)残留量

摘?要：目的：土霉素是限制我国淡水鱼深加工产品出口的关键抗生素之一；此外，由于水污染加重，淡水鱼中藻毒素残留问题也很严重。研究和开发同时快速检测技术已成为当前急需解决的问题。方法：鲫鱼鱼肉进行不同前处理，利用高效液相色谱测定毒素残留量。结果：土霉素和微囊藻毒素的最低检测限分别为0.1μg/kg、5ng/L。质量浓度范围0.1～5.0μg/mL的土霉素、微囊藻毒素标准品制备标准曲线，线性关系较好，相关系数分别为0.995、0.998。精密度分别为1.82%、1.68%；回收率范围分别88.1%～102.8%、90.6%～105%。结论：对比酶联免疫反应试剂盒的检测，2种方法结果没有太大差别。

关键词：土霉素；微囊藻毒素(MC-LR)；高效液相色谱；同时检测

中图分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123(2013)10-0009-03

土霉素(OTC)是水产养殖中治疗活性气单胞菌属败血症及假单胞菌属败血症的常用抗菌药物之一[1]，微囊藻毒素(microcystin，MC-LR)是水体富营养化引起藻类(蓝藻)大量繁殖所释放的毒素。土霉素和微囊藻毒素的过度使用和环境恶化会引起这些毒素在鱼体中的蓄积并导致细菌的耐药性，具有免疫抑制影响导致肝损害等副作用。

检测土霉素的方法主要有固相萃取和高效液相色谱法[2]。检测微囊藻毒素的方法主要有高效液相色谱法、液质联用法、酶联免疫法等[3-6]。目前没有同时检测鱼体中这2种毒素的方法。本实验采用水洗、酸洗、碱洗、煮制、腌制5种不同的前处理方法后，建立1种能同时检测土霉素和微囊藻毒素高效液相色谱方法。同时对比分析不同处理方法对残留量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲫鱼购买于当地菜市场。

乙腈、甲醇(色谱纯)；磷酸二氢钠。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司；高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；KKQ-100E超声波清洗器 杭州萧山余祝超声波设备厂；HWS-12恒温水浴锅 上海沪粤明科学仪器有限公司；TAIKANG/R2002KE旋转浓缩仪 上海互佳仪器设备有限公司；S10高速匀浆机 杭州诺丁科学器材有限公司；HLB固相萃取柱 上海楚定分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 水洗

鲫鱼去刺取肌肉部分绞碎后，与4℃蒸馏水按3:1(mL/g)混合。用玻璃棒搅拌2min，4℃冷冻离心(10000×g，10min)。得到的沉淀按3:1(mL/g)加蒸馏水(4℃)，用玻璃棒搅拌2min，4℃冷冻离心(10000×g，10min)。得到的沉淀即是水洗脱腥鱼糜。

1.3.1.2 酸碱洗

鲫鱼去刺取肌肉部分绞碎后，按9:1(mL/g)加蒸馏水(4℃)，用匀浆机匀浆(10000r/min，30s)，鱼浆用双层纱布过滤除结缔组织。调整pH值(酸提pH2.3，碱提pH11.8)，整个过程保证温度低于10℃；pH值达到目的值后继续搅拌提取蛋白质30min；4℃冷冻离心(5000×g，20min)，去掉沉淀；调上清液pH值到5.5，沉淀蛋白质；4℃冷冻离心(5000×g，20min)，下层沉淀即为酸碱法提取的鲫鱼蛋白[7]。

1.3.1.3 煮制

鲫鱼去刺取肌肉部分切片，清水洗净。放入干净玻璃器皿中，加蒸馏水在电磁炉上加热至沸腾。取出放置室温时绞碎备用。

1.3.1.4 腌制(湿腌)

鲫鱼去刺取肌肉部分切片，清水洗净，将其泡在质量分数15%的盐溶液中。盖上保鲜膜常温条件下腌制6h，腌制好后绞碎备用。

1.3.2 样品处理

准确称取上述前处理鱼各5.0g于50mL三角瓶中，加入10mL 80%甲醇，超声5min(80W，20kHz)，将甲醇提取液转入离心管中，8000r/min离心10min；如此重复提取3次，合并上清液，旋转浓缩至约10mL，再8000r/min离心10min。取15mL甲醇加入ODS小柱内进行活化，用20mL超纯水洗涤小柱，然后将离心样品(1mL)转ODS柱内缓慢通过，用10%甲醇2mL洗涤柱子，再用含有0.1%三氟醋酸的甲醇溶液2mL解吸，收集解吸溶液于50mL烧杯中并置75℃水浴中挥发甲醇溶液，用超纯水洗涤烧杯后转入1mL刻度具塞比色管内，调节pH值至中性。经0.45μm微孔滤膜过滤，供HPLC分析。

1.3.3 色谱条件

Crosmosile ODS色谱柱(250mm×4.6mm)；流动相A：0.01mol/L磷酸二氢钠溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0.0～4.5min、30% B，4.5～5.0min、60% B，5.0～7.8min、70% B，7.8～10.0min、95% B，10.0～13min 30% B；检测波长：λ1=238nm、λ2=355nm；流速1mL/min；

柱温40℃。

1.3.4 标准品系列配置及样品测定

分别配制质量浓度0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/mL土霉素(用甲醇稀释)和微囊藻毒素(用20%甲醇稀释)标准品溶液。混合标准品土霉素(40μg/mL)与微囊藻毒素(0.2μg/mL)按4:1(m/m)配置，避光贮存。进样量5μL，以色谱峰的峰面积(y)为纵坐标，与其对应的溶液质量浓度(ρ，μg/L)为横坐标绘制标准曲线。同样色谱条件对样品进行检测(进样量20μL)。

2 结果与分析

2.1 方法和流动相的选择

根据土霉素和微囊藻毒素的紫外吸光特性，设定吸光波长分别为土霉素238nm、微囊藻毒素355nm。最初选择流动相A：超纯水；流动相B：乙醇，洗脱程序为0.0～5.0min、10% B，5.0～10.5min、90% B，10.5～12.0min、10% B。土霉素出峰峰形良好，可是微囊藻毒素出峰基线不稳。调整方法时根据国标改变流动相为乙腈和0.01mol/L磷酸二氢钠[8]，根据1.3.3节洗脱程序，两种毒素各峰分离完全，且峰形良好，保留时间稳定，见图1。

由图2可知，在同样色谱条件下，注入按1.3.4节配制好的混合标准品，在9.8min左右出现1个峰，在波长238nm处响应值很高，分析可能波长238nm比较低，很容易吸收微囊藻毒素标准品(纯度95%)中的杂质。

2.2 方法的检出限和线性范围

按1.3.4节操作，回归方程及相关系数分别为土霉素y1=1234.0ρ1＋1358.9，相关系数R2=0.9949；微囊藻毒素y2=35717ρ2＋11382，相关系数R2=0.9976；检出限为土霉素0.1μg/kg、微囊藻毒素5.0ng/L。

2.3 精密度实验

取质量浓度1.0μg/mL土霉素、微囊藻毒素标准品溶液，在上述色谱条件下，进行重复测定(n=6)，计算精密度。如表1所示，其相对标准偏差(RSD)分别为土霉素1.82%、微囊藻毒素1.68%。

2.4 回收率实验

鱼肉样品进行土霉素和微囊藻毒素0.1、0.5、5.0μg/mL 3个水平分别测定在鲫鱼肌肉中的回收率，结果见表2。

2.5 不同处理方法的比较

5种前处理方法中，水洗方法土霉素测定含量为142.4μg/kg，其余都超出国家标准含量(我国水产品土霉素最大残留限量为200μg/kg)[9]。原因可能是处理时受到了水质污染。鱼肉样品中微囊藻毒素未检出。

如图3所示，在3min之前出峰可能是处理样品掺入的杂质，与标准品对应没有大的影响。

3 讨?论

用酶联免疫反应快速检测试剂盒检测提取出来的鱼肉样品，结果显示水洗、酸洗、碱洗、煮制、腌制微囊藻毒素残留量分别为1.26、1.04、2.64、0.35、0.31ng/L，由此可知不同处理方法，其残留量不同。原因可能是不同处理方式，导致了鱼肉蛋白变性，影响了毒素在固相萃取柱上的有效吸附从而导致回收率不同。由于残留量少，在高效液相色谱中未能检出，但在人体健康允许范围内该研究方法具有实际意义。本方法根据国标方法进行改进，主要探究了在鱼肉中有可能存在的两种毒素，并建立了高效液相色谱方法，其结果能满足淡水鱼加工处理的分析要求，可运用在实际检测中。

参考文献：

[1] 秦峰, 陈国颖, 仇士林. 时间分辨荧光法高通量筛选鱼肉组织中土霉素的残留量[J]. 中国抗生素杂志, 2008, 33(9): 561-563.

[2] 庞国芳, 曹彦忠, 张进杰, 等. 高效液相色谱法同时测定禽肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的研究[J]. 分析测试学报, 2005, 24(4): 61-63.

[3] 吴伟文, 杨左军, 顾浩飞, 等. 固相微萃取/高效液相色谱法测定水中的微囊藻毒素[J]. 分析测试学报, 2007, 26(4): 545-547.

[4] 林瑶, 张琼, 李一丹. 固相萃取-高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(9): 2174-2175.

[5] 虞锐鹏, 陶冠军, 贡小清, 等. 高效液相色谱-质谱联用方法测定背角无齿蚌体内微囊藻毒素[J]. 分析测试学报, 2007, 26(5): 671-674.

[6] 徐立红, 陈加平, 黄兆辉, 等. 用蛋白磷酸酶抑制法测定水体中的微囊藻毒素类物质[J]. 环境科学学报, 1999, 19(5): 536-539.

[7] HULTIN H O, KELLEHER S D. Process for isolating a protein composition from a muscle source and protein composition: US, 6288216 B1[P]. 2001-09-11. [2013-10-30 ]

[8] 辽宁省食品卫生监督检验所. GB/T5009.116―2003 畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定: 高效液相色谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

[9] CARIGNAN G, CARRIER K, SVED S. Assay of oxytetracycline residues in salmon muscle by liquid chromagraphy with ultra vialet detection[J]. Journal of AOAC International, 1993, 76(2): 325-328.