糖谱及其在中药多糖质量控制中的应用

[摘要]多糖是生命四大基础物质之一，兼具有多方面药理活性，是中药主要功效成分之一。近年来，随着分析技术的进步和分子生物学的发展，糖的研究也取得巨大进展，多糖类药物和保健品的研究正成为生命科学研究中又一新的前沿和热点。然而，多糖质量控制是多糖类新药研发中的瓶颈，提高中药多糖质量控制研究至关重要。由于中药多糖化学结构复杂、多样性大，其质量控制一直是难点并极具挑战性。实际上，中药多糖的生物活性与其结构特征密切相关，建立基于结构特征的中药多糖质量控制方法，对于保证中药多糖的安全有效至关重要。因此，该文首先对中药多糖生物活性与其化学结构关系进行归纳总结，提出中药多糖5种作用机制，阐明中药多糖质量控制的必要性和重要性;在此基础上，介绍基于糖谱法的中药多糖质量控制策略和应用，旨在为中药多糖质量研究提供新思路。

[关键词]糖谱;中药多糖;质量控制;构效关系;作用机制

Saccharidemappinganditsapplicationinqualitycontrolof

polysaccharidesfromChinesemedicines

LIShao-ping*，WUDing-tao，ZHAOJing

（StateKeyLaboratoryofQualityResearchinChineseMedicine，InstituteofChineseMedicalSciences，UniversityofMacau，Macao999078，China）

[Abstract]PolysaccharideswithmultiplebiologicalactivitiesareusuallyconsideredasoneofthemajorbioactivecompoundsinChinesemedicines（CMs）.Atpresent，thedevelopmentofdrugandfunctionalfoodsrelatedtopolysaccharideshaveattractedagreatdealofattentionduetotheirgreatpotentialeffectsanddiverseactionmechanisms.However，qualitycontrolofpolysaccharidesisthebottle-neckandachallengeduetotheircomplexityandchemicaldiversity.Actually，thebioactivitiesofpolysaccharidesarecloselyrelatedtotheirmolecularstructures.Inordertoensuretheirsafetyandefficacy，thedevelopmentofnovelapproachesbasedonthemolecularstructuresfortheimprovementofqualitycontrolofpolysaccharidesissignificantlyimportant.Therefore，inthisarticle，therelationshipbetweenbiologicalactivitiesandchemicalstructures，aswellastheactionmechanismsofpolysaccharidesfromCMsweresummarizedfirst.Furthermore，saccharidemapping，anovelstrategyforqualitycontrolofbioactivepolysaccharidesfromCMs，wasintroducedandtheapplicationandperspectiveswerealsodiscussed.

[Keywords]saccharidemapping;polysaccharides;qualitycontrol;structure-bioactivityrelationship;actionmechanism

doi：10.4268/cjcmm20151729

多糖是由10个或以上单糖通过缩合而形成的链状结构物质。多糖广泛分布于动物、植物和微生物中，对维持生命活动起着至关重要的作用，与蛋白质、核酸、脂类并称为生命四大基础物质。现代药理研究证实，多糖，特别是水溶性多糖常具有非常重要的生物活性，如抗肿瘤、免疫促进、抗氧化、抗凝血、抗炎、抗病毒、抗衰老、降血糖、降血脂药理活性等^[1]，是中药的重要功效成分之一。实际上，中药多糖的功能活性与其结构特征（如相对分子质量及其分布、单糖组成、糖苷键类型及连接顺序、粒径大小、溶液链构象等）密切相关^[2]。因此，中药多糖的质量控制对确保其安全性和有效性至关重要。然而，由于多糖的复杂性以及相对分子质量的多分散性，中药多糖的质量控制一直是中药分析的难题。

本文首先对中药多糖生物活性与其结构特征关系进行归纳总结，提出中药多糖5种作用机制，阐明中药多糖质量控制的必要性和重要性，在此基础上，介绍基于糖谱法的中药多糖质量控制策略和应用，旨在为中药多糖质量研究提供新思路。

1中药多糖生物活性与其结构特征

国内外对中药多糖的生物活性与其结构特征的研究经过近几十年的快速发展，已取得很大突破。越来越多的药用植物和药用真菌多糖得到研究，很多中药多糖，特别是水溶性多糖具有非常重要和特殊的生物活性，在抗肿瘤、免疫促进、抗氧化、抗凝血、抗炎、抗病毒、降血糖和降血脂等方面显示出良好的应用前景。作者总结了近年来不同中药来源多糖的主要生物活性及其结构特征，见表1。实际上，中药多糖的药理活性与其相对分子质量、单糖组成、糖苷键类型、高级构象等密切相关。例如研究表明昆布多糖^[3]和海藻多糖^[4]抗氧化活性随其相对分子质量降低而增加，而海藻多糖抗凝血活性则随其相对分子质量降低而降低^[5]，牛樟芝多糖需要相对分子质量大于100kDa才具有明显抗血管生成作用^[6]。糖苷键类型对多糖生物活性同样有重要影响，多数药用真菌活性多糖主链类型均为β-1，3-葡聚糖^[7-9]，枸杞活性多糖主要为阿拉伯半乳聚糖-蛋白复合物^[10-13]、而手掌参多糖的免疫活性明显受其α-1，4-半乳糖醛酸和β-1，4-甘露糖苷键影响^[14]。此外，一些特殊单糖也对多糖生物活性起着决定性作用，如岩藻糖与灵芝糖肽的免疫调节和抗肿瘤活性有着密切关系^[15-16]。多糖的高级构象也影响其药理活性，例如香菇多糖的抗肿瘤活性与其三螺旋结构密切相关^[17]。因此，比较研究中药多糖与生物活性相关结构特征，建立基于结构特征的中药多糖质量控制方法，对于保证中药多糖的安全有效至关重要，是中药多糖质量控制的基础。

2中药多糖作用机制

长期以来，基于传统上对多糖体内过程的认识，常有多糖口服能否发挥功效的质疑。随着科学技术的发展，人们对多糖作用的认识越来越深入，并已发现体内有多糖受体存在。目前，多糖抑制肿瘤细胞生长的作用机制至少包括：①多糖或其寡糖片段通过与免疫细胞表面的受体结合（Dectin-1，CR3，TLR-2/6等），激活免疫系统并释放细胞因子吞噬或杀伤肿瘤细胞^[46-47];②多糖或其寡糖片段通过与细胞生长因子（EGF，bFGF等）或相关酶（磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸化激酶等）结合，抑制肿瘤细胞的生长^[48-49];③多糖或其寡糖片段与促血管生成因子和促血管生成因子受体相结合，调节microRNAs阻断血管生成饿死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞凋亡^[50-53]。综合现代研究结果，有理由推测口服多糖发挥生物活性的作用机制至少有以下5种：①少数多糖或其寡糖活性片段直接被吸收进入血液，从而与靶标细胞作用（如巨噬细胞和树突状细胞等）发挥功效^[54-56];②多糖或其寡糖活性片段直接通过Peyer′s（集合淋巴）结或肠系膜淋巴结^[57]激活肠适应性免疫应答反应;③与胃肠道上皮细胞具有相似聚糖抗原决定簇的糖蛋白、糖脂和可溶性寡糖识别并结合病原体，减少病原体对宿主细胞的附着从而降低宿主细胞被感染风险^[58-59];④多糖经肠道菌群代谢成短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸等）调节免疫应答^[60-61];⑤多糖作为肠道菌群的益生元，诱导有益于宿主健康的共生菌生长^[61-63]。

特别地，除了通过上述直接作用发挥药理作用外，中药多糖在疾病治疗过程中还具有其他重要作用，如提高或者降低小分子化合物毒性^[64]，作为其他活性成分的天然稳定剂、增溶剂和天然药物载体等^[65-66]。因此，对中药多糖的这些作用研究有利于进一步阐明中药的整体作用效应。目前，中药多糖多样化的生物活性及其多途径的活性作用机制，使多糖类药物和多糖类医药保健品的开发与研究成为当前新药研究的热点，然而多糖质量控制是多糖类新药研发中的瓶颈，提高中药多糖质量控制研究至关重要。

3糖谱法的建立

中药多糖的质量控制包括定性分析和定量检测2个方面内容，由于多糖的复杂性，建立简便快速、准确性好、特异性高的定性定量方法多年来一直是中药多糖质量控制的关键与瓶颈。经典的多糖鉴别方法包括分离纯化、纯度鉴定，以及一系列化学结构特征表征（包括相对分子质量、组成糖、糖苷键类型以及连接顺序、溶液链构象、立体形状、流变行为和热稳定性分析等）[7，67]，尽管该方法定性鉴别多糖准确可靠，但操作繁杂、难度大、耗时长，无法用于中药多糖的日常质量控制研究^[2]。此外，基于部分酸水解产物色谱特征的多糖定性分析^[68-70]和完全酸水解的多糖定量测定[1，71-72]，虽已被广泛应用，但特异性和准确性差^[73-74]。有鉴于此，本课题组提出了用于多糖定性分析和定量检测的糖谱法（saccharidemapping）策略^[75-77]，该方法通过系列定位酶切技术联用各种色谱（HPSEC，HPTLC，PACE等）分析，结合多糖活性评价[14，78]，可实现基于活性结构特征的多糖定性、定量分析，并成功应用于多种中药多糖及其产品的质量控制[75，79-87]，糖谱法的基本流程示意图见图1^[2]，即首先采用色谱技术建立待测多糖酶解前的特征图谱（StepⅠ）;随后，采用糖苷酶定位水解待测多糖，并采用相应的色谱方法比较多糖对糖苷定位酶解的响应特征，实现待测多糖的辨别（StepⅡ）;也可进一步采用色谱技术分离分析待测多糖酶解产物，并以其中稳定和特异的多糖水解片段为指标，实现待测多糖的定性定量分析（StepⅢ）。与多糖其他定性定量方法相比，糖谱法以酶催化水解，具有选择性好、特异性高、反应条件温和、产物稳定等优点，是一种高效特异的多糖质量控制策略。

StepⅠ，酶水解前2种多糖色谱图（具有相同相对分子质量和糖组成，但不同糖苷键）;StepⅡ，根据多糖对糖苷酶E1定位酶解响应特征，实现多糖鉴别;StepⅢ，比较分析多糖经糖苷酶E2定位水解后产物的色谱特征，实现多糖鉴别。

4糖谱法的应用

4.1定性鉴别基于多糖对不同酶定位水解的响应差异及水解产物的色谱特征，可实现不同来源多糖的鉴别分析，根据分离技术的不同，目前糖谱法分别有基于荧光辅助凝胶电泳（PACE）的糖谱法、基于高效薄层色谱（HPTLC）的糖谱法和基于高效液相色谱（HPLC）的糖谱法等。特别地，PACE是一种十分便捷的多糖酶解产物分离技术，具有分辨率高、重复性好、稳定性高、可多个样品同时分析等特点^[83]。由于糖类化合物不带紫外或荧光基团，通常在进行PACE分析之前，需要对水解产物做衍生化处理，8-氨基萘-1，3，6-三磺酸钠（ANTS）和1-氨基芘-3，6，8-三磺酸（APTS）是针对糖类化合物还原端的衍生化试剂，2种试剂均同时具有紫外和荧光基团，具有较高的灵敏度。采用PACE糖谱法，分别分析了不同来源冬虫夏草^[81]、北虫草^[78]、竹荪^[80]、猴头菇^[79]、手掌参^[14]、枸杞和灵芝的多糖酶解产物^[83]，结果有利于区别和鉴定不同来源的中药多糖。不同来源灵芝多糖的β-1，3-葡聚糖内切酶和果胶酶酶解产物的PACE图谱见图2，以及不同来源虫草多糖的α-淀粉酶和β-葡聚糖内切酶酶解产物的PACE图谱。结果表明基于灵芝（紫芝和赤芝）多糖的β-1，3-葡聚糖内切酶和果胶酶酶解产物（图2A，B），能够实现不同灵芝伪品的鉴别，以及基于天然冬虫夏草多糖的α-淀粉酶和β-葡聚糖内切酶酶解产物（图2C，D），能够实现不同虫草伪品的鉴别。此外，通过比较不同酶定位水解前后多糖的生物活性，可以明确影响多糖生物活性的主要糖苷键类型，实现多糖活性相关结构特征分析，有利于进一步提高中药活性多糖的质量控制。采用β-甘露聚糖内切酶和β-葡聚糖内切酶水解处理手掌参多糖（GC6P）后，其相应酶解产物（GC6P-M和GC6P-G）的免疫活性得到提高（图3A），而采用阿拉伯聚糖内切酶和果胶酶水解处理手掌参多糖后，其相应酶解产物（GC6P-E和GC6P-P）的免疫活性降低（图3A）。表明手掌参多糖的α-1，4-半乳糖醛酸、β-1，4-甘露糖、α-1，5-阿拉伯糖以及β-1，3（4）-葡萄糖（GC6P-G）糖苷键与其免疫活性相关，特别是α-1，4-半乳糖醛酸和β-1，4-甘露糖糖苷键显著性影响手掌参多糖的免疫活性。图3B是GC6P经不同糖苷酶（β-甘露聚糖内切酶、β-葡聚糖内切酶、阿拉伯聚糖内切酶和果胶酶）水解后产物PACE特征谱，结果表明产物间存在明显差异^[14]。该方法也成功用于不同产地人工北虫草多糖的活性结构特征分析^[78]，发现北虫草多糖的免疫活性与其α-1，4-和β-1，4-葡萄糖糖苷键密切相关。

A和B分别为不同来源灵芝多糖的β-1，3-葡聚糖内切酶和果胶酶水解产物的PACE糖谱;C和D分别为不同来源虫草多糖的α-淀粉酶和β-葡聚糖内切酶水解产物的PACE糖谱;GSM，无柄灵芝;AM，假芝;GS，紫芝;IO，桦褐菌;GA，平盖灵芝;GC，薄树芝;GL，赤芝;TV，云芝;FF，木蹄层孔菌;GT，热带林芝;GTC，人工培养热带灵芝;LR，虎乳灵芝;AC1-AC8，不同来源虫草，AC1和AC8为古尼虫草，AC2和AC4为山虫草，AC3和AC6为亚香棒虫草，AC5为新疆虫草，以及AC7为蝉花;NC，天然冬虫夏草;S1-S4，分别为右旋糖酐、聚半乳糖醛酸、可溶性淀粉、燕麦葡聚糖的相应酶解产物，作为参照。

PACE糖谱法虽然分离效果好，荧光检测灵敏，但凝胶需现用现制，不利于提高方法的重复性。HPTLC同样具备简便快速、高效灵敏等特点，检测用苯胺-二苯胺显色法灵敏度优于液相色谱常用的示差检测器（RID）和蒸发光散射（ELSD）检测器^[88]，可以多个样品同时分析，方便结果比较^[1]。基于HPTLC的糖谱法能同时监测多糖对糖苷酶的响应特征和分析水解产物，比较人参属3种药用植物，即人参、西洋参和三七多糖的酶解响应以及酶解产物特征发现，三七、人参和西洋参多糖的纤维素酶、右旋糖苷酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、果胶酶酶解产物基本一致，揭示三七、人参和西洋参具有相似的葡聚糖和果胶类型的多糖^[82]，结果可为合理利用人参、西洋参和三七多糖提供依据。然而，HPTLC对聚合度较高（DP>15）的糖类化合物分离能力较弱^[1]，虽PACE能够分离DP>40以上的多糖^[89]，但采用ANTS衍生试剂辅助的PACE对单糖均无分离作用，如将PACE和HPTLC组合使用，则能够较全面地分析多糖的水解产物特征。采用PACE和HPTLC比较研究不同来源虫草多糖果胶酶酶解产物^[81]和不同产地枸杞多糖果胶酶酶解产物表明：PACE适合较高聚合度的糖分析，而HPTLC则适用于低聚合度糖及单糖分析（图4）。此方法具有简便实用、重复性好、灵敏度高、通量大等优点，有望成为中药多糖质量研究的常规分析方法。

HPLC是天然化合物分离分析的最常用方法，据近3年约750篇药食两用植物化学成分分析论文统计，液相色谱使用率超过50%^[90]。LC分离多糖的常用方法为分子排阻色谱（SEC）或称凝胶滤过色谱（GPC），由于其分离能力较弱，无法同时分离多糖及其水解产物，此外，由于多糖无紫外吸收，与其联用的ELSD和RID检测灵敏度相对较低，通常用于辨识多糖对糖苷酶的响应特征，随着分离材料的改进，HPLC尤其是HPLC-MS在糖谱法酶解产物的分析中将发挥重要作用。糖谱法联用HPSEC-ELSD和HPLC-DAD-MS已被用于比较天然冬虫夏草多糖与人工冬虫夏草多糖的化学结构特征，结果表明：天然和人工冬虫夏草多糖具有相似的酶解响应特征，均具有β-1，4-葡萄糖苷键、α-1，4-和α-1，6-葡萄糖苷键、以及β-1，4-甘露糖苷键;但天然和人工冬虫夏草多糖果胶酶酶解产物存在差异，果胶酶酶解产物HPLC-DAD/MS谱能够鉴别2种不同来源多糖^[87]。基于HPSEC-ELSD糖谱法也被成功应用于比较不同来源石斛多糖^[86]和评价不同来源灵芝多糖及其产品质量^[85，91]。研究表明，多糖生物活性还与其相对分子质量大小、粒径及溶液链构象密切相关。HPSEC-RID-ELSD虽可测定多糖相对分子质量，但测定所需已知相对分子质量的多糖对照品难得，且测定准确度受对照品与待测多糖的空间构型差异影响明显。近年来，多角度激光光散射（MALLS）在高分子特征分析方面得到快速发展，HPSEC-MALLS-RID可直接测定多糖重均相对分子质量（Mw）、粒径、溶液链构象等。基于HPSEC-MALLS-RID分析的糖谱法结果表明：国产不同公司生产的香菇多糖注射液虽均含有β-1，3葡聚糖，但不同企业以及同一企业不同批次的香菇多糖注射液在相对分子质量分布、粒径大小和高级构象上存在较大差异^[84]，提示国产香菇多糖注射液的质量一致性差，质量评价方法亟待提高，以确保香菇多糖注射液的安全性和有效性。

4.2定量分析多糖的定量分析方法主要分为比色法、高效液相色谱法和气相色谱法等。常用的比色方法主要为苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、咔唑-硫酸法和间羟联苯法。前2种主要用于多糖的总糖含量测定，后2种主要用于酸性糖（糖醛酸）的含量测定，但咔唑-硫酸法准确度受中性糖影响较大，而间羟联苯法则不受中性糖影响^[92]。目前，苯酚-硫酸法是测定多糖含量最常用的方法，被广泛用于中药多糖的含量测定^[73]。然而，以葡萄糖为参照定量的苯酚-硫酸法，其准确度常受待测多糖的单糖组成影响显著^[77]。高效液相色谱法和气相色谱法也用于多糖定量分析，即利用测定多糖经完全酸水解后释放出单糖含量计算多糖含量，与比色法相比较，具有较高的灵敏度、稳定性和重复性。但酸水解条件对测量结果有很大影响，需要对不同多糖分别进行酸水解条件优化，以尽可能使多糖完全水解又不使产生的单糖发生破坏，才能获得满意结果。实际上，无论是比色法，还是高效液相色谱法和气相色谱法，测定的都是总糖含量。由于多糖生物活性与其相对分子质量及分布密切相关，因此，建立一种快速测定多糖及其不同组分含量的方法对于多糖研究是十分必要的。尽管HPSEC-RID和HPSEC-ELSD方法结合相应的多糖对照品定量曲线能够实现多糖及其不同组分的含量测定^[93-95]，由于天然多糖的复杂性，实际工作中难以获得相应的多糖对照品。为此，本团队建立了一种简单、准确、不需对照品的HPSEC-MALLS-RID多糖定量方法^[77]，该方法首先采用HPSEC对多糖进行分离;随后采用MALLS测定多糖相对分子质量;最后利用多糖浓度与多糖比折光指数增量值的关联方程Ci=α（Vi-Vibaseline）/（dn/dc）计算多糖及其不同组分的含量（式中α是示差折光检测器仪器常数，Vi和Vibaseline是多糖示差信号和基线信号，dn/dc是多糖比折光指数增量）。结果表明，HPSEC-MALLS-RID结合多糖通用dn/dc值（0.15mL・g-1）测定不同多糖对照品及混合多糖对照品的平均回收率为90.6%～98.3%，并且能够准确测定混合多糖对照品中不同组分的比例（图5）。该方法与传统的苯酚-硫酸法相比，不需要对多糖进行水解处理和制备定量标准曲线，定量准确度远优于苯酚-硫酸法;与传统的基于标准多糖定量曲线的HPSEC-RID或HPSEC-ELSD方法比较，HPSEC-MALLS-RID法不需要多糖对照品，同样能够对多糖及其不同组分准确定量。应用基于多糖比折光指数增量的HPSEC-MALLS-RID方法评价不同培养条件下人工冬虫夏草活性多糖（相对分子质量大于10kDa的组分）含量发现^[96]，特定的培养条件可选择性提高人工冬虫夏草多糖中活性组分的含量，而与总糖含量无明显相关，提高了研究结果的可靠性，避免多糖定量方法特异性差造成的判断偏差，有利于通过优化冬虫夏草发酵条件，获得高产活性多糖。因此，在对中药活性多糖及其组份进行定量分析时，该方法的优势尤为突出。特别地，采用基于HPSEC-MALLS-RID的糖谱法，可对多糖酶解产物中的特征片段进行准确定量测定，实现对特定结构特征多糖的定量分析。

5展望

糖谱法是一种方便、准确的多糖质量控制新方法，目前研究主要集中于中药多糖的表征及活性相关特征研究。因此，对中药多糖酶解产物进行化学结构特征分析，建立特征多糖定量方法;利用高分辨串联质谱和糖结构相关的数据库软件分析工具探讨糖谱在复杂多糖结构解析方面的应用;利用酶固定化技术提高酶制剂利用率和发挥糖谱法在多糖构效关系研究中的作用将是糖谱法研究的热点。建立多糖酶解产物多维色谱特征分析，实现基于多糖多元参数，如单糖组成、糖苷键类型、相对分子质量、粒径及高级构象表征的糖谱法，拓展其在中药质量控制中的应用。

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