化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注(MCAO)后脑组织氧自由基和NOS表达的影响

（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学，江苏 南京 210029）

摘 要：目的：观察化瘀通络方治疗大鼠局灶性脑缺血－再灌注损伤对脑组织自由基及一氧化氮合成酶（NOS）和iNOS变化的影响。方法：制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，给予化瘀通络方治疗后观察丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及一氧化氮合成酶（NOS）和诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的变化。结果：化瘀通络方可显著降低MDA含量以及iNOS和NOS活性，SOD含量升高。结论：在脑缺血再灌注损伤后, 化瘀通络方能抑制脑缺血再灌注后脂质过氧化反应，促进自由基清除，对抗自由基损伤，提高脑组织自身抗氧化能力，降低NOS和iNOS介导脑缺血－再灌注时的神经损伤，保护脑细胞。

关键词：化瘀通络方；脑缺血-再灌注损伤模型；SOD；MDA；NOS；iNOS

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717（2011）03-0509-03

Effect of Huayu Tongluo Fang on the Expression of ROS and NOS in Brain

Tissue During the Reperfusion After Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats

QIU Zhao-juan1，ZHU Xuan-xuan1，DA Qing-guo1，WU Xu-tong1-ZHU Wu-yuan2

（1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjiang 210029,Jiangsu,China;

2.Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029,Jiangsu,China）

Abstract:Objective:To observe the effect of huayutongluofang on expression of ROS,NOS and iNOS during the reperfusion after middle cerebral artery occlusion in rats. Methods:The cerebral IR rats model were established by middle cerebral artery occlusion.Treated the cerebral IR rats with huayutongluofang,then observing the changes of MDA,SOD,NOS and iNOS in brain tissue. Results:Huayutongluofang could reduce the expression of MDA,iNOS and NOS in brain tissue.While, after huayutongluofang treatment,the SOD level in brain tissue was increased.Conclusions:During the reperfusion after middle cerebral artery occlusion,huayutongluofang can restrain the Lipid Peroxidation,promote removal of oxygen free radicals, compete oxygen-free radical injury. While,runhoukaiyinkeli could reduce the possibility of nerve damage,protect neural cells from injured.省略。

缺血性脑卒中（Ischemic Cerebral Stroke, ICS），中医又称缺血性脑中风，是一种突然起病的脑部血液循环障碍性疾病。祖国医学将其列为“风、痨、臌、膈”四大疑难病之首。根据WHO公布的有关数据显示，世界范围内ICS的发病率为150～200人／10万人口。而在我国，60岁以上老年人ICS发病率高达30%～45%，幸存者中约50%留有不同程度的后遗症，且复发率高达40%～60%。ICS在临床表现以猝然昏扑导致口眼歪斜、半身不遂、智力障碍为主要特征，严重影响患者生活质量，已成为前3位的疾病死因之一，其病因和治疗药物一直是研究热点。近年来,中药在缺血性疾病治疗中的作用逐渐得到重视。化瘀通络法是我院神经内科经多年临床实践研制并应用于临床脑梗塞病人，前期临床研究发现化瘀通络方能明显改善神经功能缺损，用其治疗急性脑出血60例，治疗组基本痊愈12例（20.0%），显效24例（40.0%），有效16例（26.7%），无效8例（13.3%），总有效率86.7%。显示出满意的临床疗效。本研究通过制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,探讨化瘀通络方对脑缺血再灌注损伤后脑组织自由基及一氧化氮合成酶（NOS）变化的影响。为化瘀通络方的临床应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验药品

化瘀通络方由葛根、当归、补骨脂、制大黄、水蛭等组成，由江阴天江药业有限公司提供，批号：0910119脑血康胶囊，山东昊福制药有限公司，批号：20100202，青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号：B091107，戊巴比妥钠，中国医药上海化学试剂公司，批号：F20091216 SOD、MDA、NOS试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20100406。

1.2 实验动物和实验用饲料

SD大鼠，雄性，280～320g，由浙江大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008-0033，实验用饲料由江苏省协同医药生物技术有限公司提供，批号20100325

1.3 实验用仪器

电子分析天平FA10047南京市计量测试所，80-2台式低速离心机，上海医疗器械有限公司手术器械厂，恒温水浴箱 HH-2，国华电器有限公司 ，756PC紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司

1.4 实验条件

实验大鼠均分笼饲养，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，室温（22±2）℃，55%～65%，光照适度，通风洁净。

1.5 实验统计

实验数据统计处理用±s表示,采用t检验,用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。

2 实验方法

2.1 实验动物分组和MCAO模型的建立

选用健康雄性SD大鼠，体重280～320g，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，大鼠按简化分层随机法，随机分为6组：（1）假手术组: 给予等量生理盐水10mL/kg；（2）脑缺血再灌注模型组：给予等量生理盐水10mL/kg；（3）脑血康胶囊组：0.9g/kg，10mL/kg；（4）化瘀通络方大剂量组：16g/kg，10mL/kg；（5）化瘀通络方中剂量组：8g/kg，10mL/kg；（6）化瘀通络方小剂量组：4g/kg，10mL/kg。

以上除假手术组和脑缺血再灌注模型组给予等量生理盐水，其余各组大鼠灌胃给药，灌胃容量10ml/kg，每日一次，连续给药7天，实验前禁食不禁水，实验时以水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射，待动物完全麻醉后，仰位固定于手术台上，颈部脱毛并消毒，于正中切开2cm，分离右侧颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA），颈内动脉（ICA），结扎ECA和CCA近心端，于ECA和ICA分叉处在ECA上穿线打一活结。在ECA上剪一小口，插入直径0.235mm的尼龙渔线，缓慢向分叉处插入，直到到达分叉处有阻力不能再插入为止。将ECA上活结系紧，固定渔线。剪断ECA，轻轻提起ECA残端使其与ECA成一直线，再缓慢将渔线向ICA插入，栓线插入深度约为（18.0±1.0）mm，在分叉处结扎，松开动脉夹，缝合皮肤，体外留少许栓线，缺血2h后将栓线抽离颈总动脉分叉处造成再灌注模型。模型成功标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Hornor征及对侧以前肢为主的偏瘫。如动物无此体征或于2h后仍不清醒者剔除。假手术组只切开皮肤，分离CCA、ECA、ICA后缝合。手术后给予抗生素青霉素抗炎。继续给药3天。

2.2 实验指标检测

2.2.1 神经行为学评分 MCAO大鼠麻醉清醒后，进行行为学评分。评分标准参考Longa等5分制法（0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。）分值越高，说明动物行为障碍越严重。观察造模后3h，24h，48h，72h神经功能行为学评分，见表1

表1 化瘀通络方对脑缺血大鼠神经行为学评分的影响

（±s）

注：与假手术组比较，P

实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠在3h、24h、48h、72h神经行为学评分高于各给药组，具有显著性差异；以3h神经行为学评分为重，24h～72h后神经行为有恢复，评分降低，化瘀通络方大剂量组在24h、48h和72h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方中剂量组在24h和48h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方小剂量组24h有显著性降低神经行为学评分作用，提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注后的神经元具有一定的保护作用，并具有减轻神经功能损伤的作用。

2.2.2 脑组织标本的制备 各组大鼠再灌注72h后,脱颈处死,断头后迅速取脑,将脑组织以冰生理盐水洗净血迹后，称取0.1g，置2mL冰磷酸盐缓冲液中于匀浆器中进行匀浆，将制备好5%脑组织匀浆用离心机3000r/min，4℃离心15min，取上清液测定SOD、MDA、NOS和蛋白含量。

2.2.3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中SOD、MDA、NOS的影响 见表2～3。

实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中MDA含量显著高于假手术组，SOD显著性低于假手术组，化瘀通络方各给药组均可不同程度降低局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中MDA含量，升高SOD活力，与模型组比较具有显著性差异。提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用与降低MDA含量和升高SOD

表2 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中MDA含量

和SOD活力的影响（±s）

注：与假手术组比较，P

表3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中TNOS

和iNOS的影响（±s）

注：与假手术组比较，P

活力有关。

实验结果提示：局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中TNOS和iNOS含量明显增高，与假手术组比较具有显著性差异，（P

3 讨 论

关于缺血再灌注引起脑神经组织损伤的机制尚不十分清楚。近年研究发现自由基及其脂质过氧化反应在脑组织缺血再灌注的病理生理过程中发挥着重要作用，是脑缺血－再灌注损伤的重要机制之一，因此，抗自由基的毒害作用成为防治缺血再灌注损伤的重要措施。MDA是脂质过氧化物的终末产物，测定其含量可反映脂质过氧化程度和自由基对脑组织损伤的程度。SOD能催化超氧化物转变成活性较低的物质，是细胞内抗脂质过氧化作用的酶性保护系统。故认为测定以上指标可综合反映缺血再灌注后脑组织损伤与抗损伤的水平。

实验结果表明，脑缺血－再灌注可导致脑组织发生脂质过氧化反应，使MDA生成增加、SOD活性明显下降，显示出自由基的毒害攻击作用，符合当今脑缺血缺氧损伤的“自由基学说”；应用化瘀通络方治疗后，大剂量组和中剂量组均可明显提高SOD活力，使 MDA生成减少。提示，化瘀通络方能抑制脑缺血再灌注后脂质过氧化反应，对抗自由基损伤，促进自由基清除，提高脑组织自身抗氧化能力，保护脑细胞。

研究表明脑缺血/再灌流早期NO增多,对脑起保护作用;但脑缺血/再灌流的损害则与再灌流期NOS大量增多有关。缺血再灌注会引起诱导型NOS（iNOS）高表达。NOS是一组同功酶，广泛存在于各类组织、细胞中。研究表明NOS有3种亚型：①神经元型（nNOS）。活性依赖于Ca2+升高，最早在神经元中发现，生理状态下有表达，病理状态下可被诱导，在脑缺血神经元损伤的早期阶段起重要作用，脑缺血后10min活性上升，3h达高峰，介导脑缺血时早期神经元损伤。②内皮型（eNOS）。活性依赖于Ca2升高，最早在内皮细胞中发现，生理状态下有表达，病理状态下可被诱导，通过维持脑血流，在脑缺血后起保护作用，脑缺血后 1h活性上升，24h达高峰。③诱导型（iNOS）。活性不依赖于Ca2，最早在巨噬细胞中发现，在脑缺血神经元损伤的晚期阶段起重要作用，脑缺血后 12h活性上升，48h达高峰，介导迟发性神经原损伤。

实验结果表明，脑缺血2h再灌注 72h后，脑组织NOS活性和iNOS活性持续增高。化瘀通络方可通过降低NOS和iNOS活性而介导脑缺血－再灌注时的神经保护作用。

脑缺血再灌注损伤的发生与多种因素有关，研究表明化瘀通络方治疗脑缺血再灌注损伤机制可能与其清除氧自由基，抑制一氧化氮合成酶的产生，抗细胞凋亡，从而保护脑组织有关。

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