乙型肝炎病毒(HBV)PCR检测与临床应用

【摘要关键词】乙型肝炎；病毒；检测

【中图分类号】R440 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0307-02

1 HBV概述

根据2004年全国HBV感染的血清流行病学调查：

1.1 一般人群HBsAg阳性率为9.09%（95年为9.75%）

接种过乙肝疫苗的人群HBsAg阳性率为4.51%

未接种过乙肝疫苗的人群HBsAg阳性率为9.51%

1.2 慢性乙型肝炎患者约为2000 - 3000万人

1.3 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者（HBsAg携带者）超过2.8亿，我国约占9300万。多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型较常见。无黄疸型HBsAg持续阳性者易慢性化。本病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。

1.4 乙型肝炎病毒（HBV）为专一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子杂交技术的进展，在肝外器官细胞也能检出HBV-DNA。通过北京鸭乙肝肝病毒试验研究提供了在肝外细胞复制的证据。人HBV也可能在肝外细胞内复制，有待深入研究。HBV感染者血清经电镜检查有3种病毒颗粒：①Dane颗粒（HBV颗粒），外壳蛋白为HBsAg，核心含有HBV-DNA及HBVDNAp（DNA-多聚酶）、HBcAg、HBeAg；②小球形颗粒；③管形颗粒。后二者为HBV复制过程中过剩的病毒外壳（HBsAg），不含核酸。

1.5 HBV基因组（HBV-DNA）由双链不完全环形结构的DNA组成，含3200个核苷酸。由于其宿主范围较小，体外细胞培养分离病毒尚未成功。近年随着分子克隆技术的应用及体外培养细胞系转染的成功，对HBV复制过程有了进一步的了解。HBV-DNA分为负链（长链）及正链（短链）所组成。其负链有4个开放读码框架（Open Reading Frame，ORF）：①S基因区，由S基因，前S2（pre-S2）基因、前S1（pre-S1）基因组成。分别编码HBsAg，pre-S、pre-S1及多聚人血清白蛋白受体（PHSA-R）；②C基因区，由前C基因和C基因组成。分别编码HBeAg及HBcAg；③P基因区，编码HBV-DNAp，并具有逆转录酶活性；④X基因区，编码HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用。

1.6 HBV复制过程 HBV基因组虽为双链环形DNA，但其复制过程有RNA逆转录病毒的特性，需要逆转录酶活性产生RNA/DNA中间体，再继续进行复制。其过程为：①在由病毒和/或细胞来源的DNA-p作用下，正链首先延伸形成共价闭合环状DNA（Covalently Closed Circular DNA）。②以此为模板，通过宿主肝细胞酶的作用转录成复制中间体。③再以此为模板，通过逆转录酶的作用，形成第一代和第二代DNA。此双链DNA部分环化，即完成HBV-DNA的复制。

2 检测方法

2.1 HBV-DNA定量检测

2.1.1 核酸直接检测法：bDNA检测技术、微孔板酶标杂交检测法。

2.1.2 PCR 定量检测法：FQ-PCR 和 ELISA-PCR。比如：实时荧光定量PCR的原理。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

本技术的原理是使用荧光基团标记探针，5′端标记荧光基团R，3′端标记淬灭基团Q，在没有PCR扩增时，由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光；而当PCR扩增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间，利用Taq酶的5′ 3′外切酶活性，将荧光探针水解，荧光基团被释放出来，由于在空间上与淬灭基团分开，则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到，一边扩增，一边检测，这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。

3 结果的报告

3.1阴性：最低检测灵敏度 拷贝/ml如：（500拷贝/ml）。

3.2阳性：具体数据拷贝/ml （如：5.0E+6拷贝/ml ）。

参考值：最低检测灵敏度 拷贝/ml。

3.3 HBV-DNA定量检测存在的问题：假阳性问题、假阴性问题、结果稳定性问题。

3.4假阳性问题：主要原因：污染、质粒、PCR扩增产物、标本及核酸提取物。

措施：UNG（尿嘧啶糖基化酶 ）体系、实验室标准化管理：ISO5189的要求、

卫生部临床核酸扩增实验室管理办法。

3.5假阴性问题：原因： 标本中存在抑制剂、实验操作问题、 由于基因突变所致。措施：稀释标本、点突变的检测、结合其他方法分析、加强与临床联系与对话。

3.6 HBV-DNA定量检测的临床应用（1） 乙型肝炎的诊断：急性HBV感染的诊断 提供直接证据 （2）抗病毒治疗方法及疗效评价（3分泌物传染性判断（乳汁等）。

4 HBV-DNA 定量检测结果与乙肝“两对半”结果的综合评价

4.1 HBsAg阴性、抗HBs（+/）而HBV-DNA阳性原因：

HBsAg滴度低，ELISA测定敏感性低，而PCR具有极高的灵敏度。

4.2 HBsAg隐匿于HBsAg/抗HBs复合物中。在HBV初期感染时，也可能是有HBV-DNA而无HBsAg。

4.2.1 HBsAg阳性而HBV-DNA阴性原因：HBV-DNA虽然存在， HBV-DNA的检测下限仅至1000或500个拷贝。

4.2.2 血中存在的HBsAg是由HBV-DNA整合到人染色体与宿主基因共同表达所致，仅表达HBsAg，所以测不到血清中病毒DNA。

4.2.3 通常 HBsAg阳性血清，PCR检测HBV-DNA的阳性率约为96%。肝组织活检样本HBV-DNA PCR检测阳性率为100%。

4.3 HBV-DNA与抗HBs的关系：

4.3.1 血清HBV-DNA PCR检测一般为阴性，极少部分亦可阳性。

4.3.2 肝组织HBV-DNA 阳性率仍可高达77.3%，说明HBV仍存在于肝脏中。

4.4 HBV-DNA与HBeAg和抗HBe的关系

4.4 1HBeAg阳性血清，HBV-DNA PCR检测几乎全为阳性

4.4.2 血清抗HBe阳性，说明病毒复制减弱，血中HBV-DNA减少，但并未完全消失。

5 HBV基因定量分析在药物治疗中的应用

5.1 尚无药物可以清除所有HBV感染者体内HBV颗粒。

5.2 临床治疗目的：尽最大可能降低病毒载量，保护未受累或功能尚存的肝细胞，改善生活质量。

5.3 常用药物。干扰素 如：α干扰素。核苷类似物 如：拉米夫定（lamivudine， LMV， 3TC）。