高留胚率水稻辽粳294成熟胚组织培养条件的优化

摘要：以高留胚率水稻辽粳２９４成熟胚为外植体，对影响高留胚率水稻愈伤组织诱导、分化的接种方式、培养基中激素水平进行研究。结果表明，用解剖刀在胚上纵切1刀后再将种子接在培养基上，种子灭菌彻底，愈伤组织诱导率高且质量较好。诱导培养基中激素６－ＢＡ和ＫＴ的浓度对愈伤组织的诱导率有极显著的影响，诱导培养基为Ｎ６＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ时，诱导率较高，可达９０．０％；分化培养基为ＭＳ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ时，绿苗分化效果好，分化率为７３．０％。

关键词：高留胚率；辽粳２９４；成熟胚；愈伤组织；诱导及分化

中图分类号：Ｓ５１１．２＋２；Ｓ３３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－1033-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ Ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ Ｒｉｃｅ Liaojing 294 ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｐｌｕｍｕｌｅ Ｒａｔｉｏ

ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｌｅｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ１，ＹＩＮ Ｓｈｅｎｇ－ｗｕ１，ＨＵＡ Ｚｅ－ｔｉａｎ１，２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｔｉａｎｊｉｎ Ｔｉａｎｌｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ.， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ Ｌｉａｏｊｉｎｇ ２９４ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｌｕｍｕｌｅ ｒａｔｉｏ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ａｎ ｉｄｅａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃａｌｌｕｓ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ６－ＢＡ ａｎｄ ＫＴ ｈａd ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ｔｏ ９０．０％ ｗｈｅｎ Ｎ６ ＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋ ０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｐ ｔｏ ７３．０％ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ＭＳ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ａｓ ｃａｌｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｉｇｈ ｐｌｕｍule ｒａｔｉｏ； Ｌｉａｏｊｉｎｇ ２９４； ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ； ｃａｌｌｕｓ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ

糙米各部位中，胚的蛋白质含量最高，而且其还含有许多其他的营养成分和生理活性物质［１，２］，但胚在稻米的加工过程中较易脱落而不能被人们食用，损失了大量的营养成分［３］。辽粳２９４（原品系代号８７－６７５）是由辽宁省农业科学院稻作研究所选育的优质高产水稻新品种［４］，其留胚率约为普通稻米的５～６倍，是不可多得的高留胚率水稻品种，是提高水稻的营养品质以及杂交育种的好材料。

随着现代生物技术的快速发展，转基因技术已成为作物品种特性定向改良的重要途径之一，建立高效稳定的再生体系则是实现基因转化的先决条件。成熟胚取材方便，不受生长季节和环境限制，外植体均匀、灭菌容易、重复性好，是遗传转化的良好受体。利用水稻成熟胚建立高频再生体系的研究已有一些报道［５－７］，但对高留胚率水稻成熟胚组织培养体系的研究报道很少。郑文静等［８］曾经以辽粳２９４为材料研究过成熟胚的诱导率和分化率，但其组织培养条件下分化率较低（４１．７％）。为此，本研究以高留胚率水稻品种辽粳２９４的成熟胚为材料，对其愈伤组织的诱导、继代及分化条件进行了分析，主要研究不同的接种方式、培养物中外源激素的剂量对水稻愈伤组织诱导及分化的影响，以期提高愈伤组织的质量和再生率，建立一套稳定、高效的高留胚率水稻的离体再生技术体系，为水稻基因工程和水稻育种服务。

１ 材料与方法

１．１ 材料

供试材料为辽粳２９４，由天津天隆农业科技有限公司提供。

１．２ 方法

１．２．１ 外植体消毒 选取成熟、饱满、无病斑的水稻种子，剥去颖壳。在超净工作台上用无菌水浸泡１ ｈ，然后用体积分数７０％的乙醇浸泡种子３ ｍｉｎ，用质量分数０．１％的升汞溶液消毒１５～１０ ｍｉｎ，无菌水冲洗４～５次。

１．２．２ 愈伤组织的诱导及继代培养 将消毒后的种子置于无菌滤纸上吸干水分，接入诱导培养基中，考察两种不同的接种方式对诱导率的影响：①将种子直接接种在培养基上（处理Ⅰ）；②解剖刀在胚上纵切1刀后将种子接在培养基上（处理Ⅱ）。接种后２４～２６ ℃下暗培养７ ｄ，将初始的愈伤组织从种胚上剥离下来，转接到新鲜的诱导培养基，继续诱导３０ ｄ后，统计出芽率。诱导及继代培养基为Ｎ６＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋６－ＢＡ＋ＫＴ＋７．５ ｇ／Ｌ琼脂＋４０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５００ ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白，设置不同的６－ＢＡ浓度（０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ ｍｇ／Ｌ）和ＫＴ浓度（０、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９ ｍｇ／Ｌ）组合，共３６个处理，每组９０个外植体，考察激素水平对愈伤组织诱导率的影响。

１．２．３ 分化培养 继代生长６０ ｄ后，选取生长旺盛、质地紧密、自然分散、呈淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织接种于分化培养基上（ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋７．５ ｇ／Ｌ琼脂＋４０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５００ ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白），培养条件为２４～２６ ℃、光照时间１４ ｈ／ｄ、光照度１ ５００～２ ０００ ｌｘ，培养３０ ｄ后可以观察到绿点的出现，统计绿苗分化率。设置培养基中不同的ＮＡＡ水平（０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍｇ／Ｌ），考察其对绿苗分化率的影响。

１．２．４ 再生植株的获得 将生长到长１ ｃｍ左右的绿芽丛切下后，接种在生根培养基（ＭＳ培养基）中，２０ ｄ左右逐渐生根，３０ ｄ后形成根系，此时，地上部分生长迅速，即可获得完整再生小植株。

１．３ 统计方法

同一试验的不同处理间首先进行双因素单个观察值的方差分析（ｎ＝１０），当差异显著时进行处理间的多重比较。愈伤组织诱导率＝诱导愈伤组织数／接种成熟胚数×１００％；绿苗分化率＝分化绿苗的愈伤组织块数／转移愈伤组织块数×１００％。

２ 结果与分析

２．１ 不同接种方式对愈伤组织诱导率及分化率的影响

接种方式对愈伤组织的诱导率、生长速度、质量及后期的分化率均有影响。处理Ⅰ愈伤组织出现较早、生长速度较快，但培养两周后愈伤组织发干、生长缓慢，可能是因为处理Ⅰ是整粒种子进行接种，内源菌灭菌不彻底，阻碍了愈伤组织的继续生长；处理Ⅱ愈伤组织出现较晚，培养约１０ ｄ后开始出现，但随后生长加快，愈伤呈乳白色，表面疏松。

比较两种接种方式下愈伤组织的诱导率及绿苗分化率，处理Ⅰ与处理Ⅱ愈伤组织的诱导率相差不多，但处理Ⅱ的绿苗分化率明显高于处理Ⅰ（图１），这可能是因为处理Ⅱ种子灭菌彻底，愈伤组织质量较好，有利于幼苗的分化。综上，确定本研究成熟胚的接种方式为处理Ⅱ，即解剖刀在胚上纵切1刀后将种子接在培养基上。

２．２ 成熟胚诱导、继代培养基配方的优化

将成熟胚接种到诱导培养基上，６～７ ｄ后可看到由盾片处长出初始愈伤组织，呈淡黄色，质地紧密，继代后愈伤组织体积逐渐变大，３０ ｄ后统计愈伤组织，结果见表１。由表１可见，培养基中不同浓度的６－ＢＡ与ＫＴ配合使用，都可以诱导出愈伤组织，但诱导率不相同。６－ＢＡ浓度为０．１ ｍｇ／Ｌ，ＫＴ浓度为０．５ ｍｇ／Ｌ时诱导率最高，达９２．２％；６－ＢＡ浓度为０，ＫＴ浓度为０．３或０．５ ｍｇ／Ｌ时诱导率最低，为３０％。

对３６种不同配比的诱导培养基的愈伤组织诱导率进行方差分析，结果显示，６－ＢＡ与ＫＴ的浓度对愈伤组织诱导率的影响达极显著水平（Ｐ＜０．０１），且两个激素间存在极显著的互作效应（Ｐ＜０．０１）。

对６－ＢＡ ６个浓度水平的平均诱导率进行多重比较（表２），结果显示，除０．２与０．４ ｍｇ／Ｌ处理、０与０．５ ｍｇ／Ｌ处理之间差异不显著外，其他处理之间诱导率的差异均达到极显著水平，６－ＢＡ浓度为０．３ ｍｇ／Ｌ平均诱导率最大，为８５．７％，０．５ ｍｇ／Ｌ时平均诱导率最小，只有３７．６％，可见过高或者过低浓度的６－ＢＡ均不利于愈伤组织的形成。

对６个ＫＴ浓度水平的平均诱导率进行多重比较（表２），结果显示，除０、０．１、０．３、０．５ ｍｇ／Ｌ与０．７、０．９ ｍｇ／Ｌ处理之间存在显著差异（Ｐ＜０．０５），０、０．１、０．３、０．５ ｍｇ／Ｌ ４个处理，０．７与０．９ ｍｇ／Ｌ ２个处理之间诱导率的差异均不显著（Ｐ＞０．０５）。０、０．１ ｍｇ／Ｌ与０．７、０．９ ｍｇ／Ｌ处理之间诱导率存在极显著差异（Ｐ＜０．０１）。其中不添加ＫＴ时愈伤组织诱导率最高，但与0.1、0.3、0.5 ｍｇ／Ｌ的处理之间差异不显著，ＫＴ浓度为０．９ ｍｇ／Ｌ时诱导率最低，可见低浓度的ＫＴ可以促进愈伤组织的形成，其浓度过高会对愈伤组织的形成产生一定的抑制作用。

由于６－ＢＡ与ＫＴ之间的交互作用极显著，所以还要对其交互作用进行分析，进而选出最优的激素配比。通过单因素分析已经确定６－ＢＡ浓度为０．３ ｍｇ／Ｌ时诱导率最高，ＫＴ在浓度为０～０．５ ｍｇ／Ｌ时作用效果差异不显著，高于其他浓度水平。因此先确定６－ＢＡ的最佳浓度为０．３ ｍｇ／Ｌ，在此基础上确定ＫＴ的最优水平。６－ＢＡ浓度为０．３ ｍｇ／Ｌ时，ＫＴ浓度为０．１或０．３ ｍｇ／Ｌ，愈伤组织诱导率均为９０．０％，高于其他试验组合，从试验成本来看，选择添加ＫＴ的浓度为０．１ ｍｇ／Ｌ。试验结果中６－ＢＡ浓度为０．１ ｍｇ／Ｌ，ＫＴ浓度为０．５ ｍｇ／Ｌ时诱导率（９２．２％）比通过多重比较选出的最优组合的诱导率（９０．０％）要高，但进一步分析发现，该组合的诱导率与周围数据的变化趋势明显不一致，且验证试验的重复性也较差，因此，仍以统计学分析的最优组合０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ为最佳诱导培养基。

２．３ 分化培养基中ＮＡＡ浓度对绿苗分化率的影响

将成熟胚接种到２．２优化的诱导培养基中诱导培养，然后分别将愈伤组织接种到含不同浓度ＮＡＡ的分化培养基中，４０ ｄ后统计绿苗分化率。结果表明，培养基中ＮＡＡ的浓度对绿苗的分化率存在极显著影响（Ｐ＜０．０１），ＮＡＡ浓度为０．８ ｍｇ／Ｌ时绿苗分化率最高（图２）。ＮＡＡ浓度过高或过低均不利于绿苗的分化。

３ 小结与讨论

以水稻成熟胚为外植体诱导愈伤组织时，不同的接种方式会影响愈伤组织的诱导率和质量，试验结果表明用解剖刀在胚上纵切１刀后再将种子接种在培养基上，诱导愈伤组织的效果要好于直接将种子接种于培养基上，这与吕孟雨等［９］的研究结果一致。培养基中的激素类型及水平也对水稻成熟胚的愈伤组织诱导率有影响。之前的研究发现Ｎ６培养基对于高留胚率的辽粳２９４愈伤组织的诱导效果较好，而分化培养基则以ＭＳ为基本培养基较好，２．０ ｍｇ／Ｌ的２，４－Ｄ比较适合于种胚愈伤组织诱导［１０，１１］。

在水稻成熟胚愈伤组织的诱导中，常用的激素有６－ＢＡ、ＡＢＡ、２，４－Ｄ、ＫＴ等，不同实验室所用的激素配比有较大差异，这可能与基因型、诱导培养基及激素等的相互作用有关。在本研究中，诱导培养基中添加了２，４－Ｄ、６－ＢＡ、ＫＴ 3种激素，通过试验及统计分析发现，对于高留胚率的辽粳２９４来说，最佳的诱导培养基为Ｎ６＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ；最佳的分化培养基为ＭＳ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ。本研究初步得出了一个高留胚率水稻成熟胚的最佳组织培养体系，为其他高留胚率水稻品种的成熟胚再生体系建立奠定了基础。

参考文献：

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