肝癌中基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的临床意义

摘　要：目的研究肝癌组织基质金属蛋白酶组织抑制因子－1(TIMP－1)的表达，探讨其与肝癌的关系及其临床意义，为临床上寻找肝癌表达的新的生物学标志物提供理论依据。方法取山东省昌邑市人民医院2008年6月一2010年6月肝癌手术切除标本36例，按照Edmondson―Steiner组织学分级标准进行分级。选用3例外伤性肝破裂患者手术肝切除标本作正常对照。使用鼠抗人TIMP--1多克隆抗体，进行免疫组织化学PV―9000通用型二步法染色。染色结果根据反应强度及面积判断，评分标准按Shimizu方法，根据两项打分之和判断。结果对照组中TIMP―1的表达为阴性。TIMP--1在肝癌中的表达阳性率为74.8％。TIMP--1的阳性表达与患者年龄、性别、甲胎蛋白(AFP)是否阳性、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是否阳性均无关(均P>0.05)。有癌栓组、无癌栓组和包膜不完整组、包膜完整组的TIMP--1在各组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。高侵袭转移组与低侵袭转移组间，TIMP--1阳性率分别为89.6％和48.3％，组间差异有统计学意义(P

关键词：肝癌；基质金属蛋白酶组织抑制因子-1；免疫组织化学

中图分类号：R735.7　文献标志码：A　文章编号：1672--4208(201I)02--0024--02

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，20世纪90年代以来，肝癌的发病率已上升至恶性肿瘤的第二位。近年来采取了以手术为主的综合治疗，由于局部复发或远处转移，肝细胞癌的死亡率仍居高不下，所以，寻找影响肝细胞癌浸润转移的多种因素对于提高疗效具有重要的指导作用。基质金属蛋白酶组织抑制因子－1(tissue inhibitors of metalloproteinase－1，TIMP－1)在肝癌发生发展中的作用，可以帮助阐明肝癌发生发展、转移的机制，寻找抗肿瘤侵袭、转移的治疗靶点。本实验采用免疫组织化学(免疫组化)PV－9000通用型二步法检测了我院2008年6月　20lO年6月期间36例肝细胞癌手术切除标本，初步探讨了TIMP－1与肝癌发生、生长及侵袭、转移的关系，为临床上寻找肝癌预后的新的生物学标志物提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　一般资料　我院肝细胞癌手术切除标本36例，其中男24例，女12例。年龄19～72岁。血清甲胎蛋白(AFP)阳性者29例，占80.5％；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性者24例，占67.0％；肿瘤直径≤5cm者14例，>5cm者22例。按照Ed―mortdson―steiner组织学分级标准，Ⅰ级4例，Ⅱ级17例，Ⅲ级14例，Ⅳ级2例。有完整包膜者11例，包膜浸润、不完整和无包膜者25例。有癌栓者7例。所有病人术前均未行任何治疗。3例外伤性肝破裂患者手术肝切除标本，作正常对照。

1.2　试剂　PV―9000通用型二步法检测试剂盒，浓缩型鼠抗人单克隆抗体TIMP―1，试剂均购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3　实验方法将制作好的标本蜡块行5μm连续切片，分别行PV―9000通用型二步法免疫组化染色。用0.01％PBs代替一抗作为阴性对照，外伤性肝破裂患者手术肝切除标本作正常对照组。常规石蜡切片脱蜡入水，3％双氧水室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBs浸泡5min，行电煮锅煮沸抗原修复法进行抗原修复。PBS液浸泡5min，甩去PBS液，滴加适当稀释好的一抗(浓缩型MMP-9稀释比例为1:50，浓缩型TIMP-1稀释比例为1:50)。37℃孵育1～2h或4℃过夜。PBS冲洗，2min×3次。滴加试剂1(po1ymet helper)，室温或37℃孵育20min，PBS冲洗，2min×3次。滴加试剂2(poly peroxidase―anti―mouse/rabbit IgG)，室温或37℃孵育20 min，PBs冲洗，2min×3次。滴加DAB显色剂显色3～8min。自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.4　免疫组化高倍镜下(40×10)取10个不同视野，每个视野计数100个细胞TIMP－1，阳性标准为细胞胞浆出现黄色、棕黄色、棕褐色颗粒，染色强度高于背景非特异性染色为准。按阳性细胞所占百分比进行分析：(一)阳性细胞

1.5　统计学处理应用SPSS 11.0统计软件包进行分析，所得计数资料用y2检验比较组间的差异。以P

2　结果

正常对照组肝标本中TIMP―1均阴性表达。TIMP―1在肝癌组织中表达的阳性率为74.8％，主要见于肿瘤细胞胞浆内，在肿瘤血管内皮细胞及胆管上皮细胞也有表达。TIMP―l与肝癌病人年龄、性别、AFP、HbsAg均无关(均P>0.05)。但各项指标对比中，分化程度较差的、包膜不完整的、有癌栓的肿瘤所占阳性率较高。有癌栓组、无癌栓组和包膜不完整组、包膜完整组的TIMP1在各组问差异均无统计学意义(均P>0.05)。高侵袭转移组与低侵袭转移组间，TIMP―1阳性率分别为89.6％和48.3％，组间差异有统计学意义(P

3　讨论

蛋白酶抑制因子广泛分布于组织和体液中的巨噬细胞和结缔组织细胞，目前，该系列包括四个确定蛋白酶抑制因子，即TIMP－1和TIMP－2和TIMP－3和TIMP－4。对TIMP－1和TIMP－2的研究较多，而对TIMP－3和TIMP－4的研究少。TIMP－1首次分离于兔骨中。一般认为其表现主要是由细胞内和细胞外的激酶激活某些激素和一些分子信息监管的分子效应引起的。在对蛋白酶抑制因子TIMP－1的表达研究中发现，强刺激的成纤维细胞调控调节生长因子，白细胞介素－1，因此能提高其中TIMP－1表达调控，至间接地调节ras基因调控。从而激活蛋白酶抑制因子抑制肿瘤浸润和转移的机制，通过抑制蛋白酶的活性，防止局部肿瘤的生长，防止和限制的肿瘤血管的形成，肿瘤形成后，肿瘤细胞逐渐分化增殖，其原有营养成分的增长，通过分散的机构提供所需的功能得到有效的控制。超过1mm或2mm的肿瘤直径，就有血管生成。此时的合成会受相关因素影响，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子等，在肿瘤内，肿瘤细胞增殖和充足的氧气，已有的研究表明，基质金属蛋白酶作为一种天然抑制因子产生对血管生成有利的条件，如阻塞基质金属蛋白酶介导的内皮细胞迁移，基质血管生成抑制因子释放，以防止细胞外基质(ECM)的降解。进一步的研究表明，蛋白酶抑制因子抑制血管生成没有产生对金属蛋白酶活性抑制的作用。最近，有研究发现，TIMP一1能抑制血管生成因子(angiopietin―1)从而诱导血管内皮细胞的发芽。Montgomery等在重组TIMP―1的高转移性入黑色素瘤细胞系中的研究发现，TIMP-1体外培养不改变其生长特性的细胞，将这些细胞高表达注射后在大鼠皮下增长缓慢。一些学者用基因转导大鼠胚胎成纤维细胞，然后注射到裸鼠皮下，肿瘤生长后18d发现TIMP―1的基因，与对照组比较，平均肿瘤体积显着减少。与此相反，对照组肿瘤肌层浸润，不仅看得见，而且侵入腹腔。这也表明，TIMP－1的抑制肿瘤细胞通过基质金属蛋白酶抑制基底膜的破坏发生。有学者Ⅲ构建了该基因全长TIMP―1的真核表达载体，并为高转移人巨细胞肺癌细胞(PG细胞)转染，我们发现，PG细胞转染TIMP―1表达增加，体外侵袭和软琼脂集落形成明显降低肿瘤在裸鼠体内自发转移，形成率也明显下降。一些学者还发现，TIMP－1抑制bFGF刺激人血管内皮细胞的生长。这一发现表明，TIMP－1的细胞外基质不仅通过抑制基质金属蛋白酶的降解，防止肿瘤的侵袭和转移，而且还通过刺激新血管形成，阻止肿瘤生长。目前，研究表明，TIMP－1的抑制通过抑制蛋白酶的活性，实现肿瘤的侵袭和转移，与之最密切相关的是MMP－9，一些学者通过TIMP－1的动物实验发现抑制细胞外基质金属蛋白酶的损害，阻碍入侵和肝癌转移，基质金属蛋白酶基因由弱转染细胞的侵袭，均显着增加TIMP－1转染细胞，对ECM的降解大大降低，在实验中TIMP－1的合成基质金属蛋白酶抑制因子也能达到类似的结果。

如上所述，TIMP－1是通过抑制蛋白酶的活性，防止癌细胞转移的。这项研究表明，TIMP－1的表达，不仅在肿瘤细胞，在肿瘤间质细胞也呈阳性。在肿瘤间质TIMP―1可能抑制肿瘤血管生成，促进肝纤维化，这还需进一步的实验进行论证。