src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF—α

【摘要】【Key words】Lipopolysaccharide； Pulmonary microvascular endothelial cells； Tumor necrosis factor； Src-suppressed C kinase substrate；Protein kinase C inhibitor；Sma...

【摘要】目的 探讨src抑制的蛋白激酶C底物（SSeCKS）对脂多糖（LPS）诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）分泌肿瘤坏死因子 （TNF） -α的影响。方法 体外培养Wistar 大鼠PMVEC，按随机数字表法分组（n=4），10 mg/L LPS刺激1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 或0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS刺激24 h；蛋白激酶C抑制剂（BIM）预处理 0.5 h或50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后再加入10 mg/L LPS孵育24 h，酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α量（ng/L）。采用SPSS10.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，以P< 0.05为差异具有统计学意义。结果 0.1、1、10 mg/L LPS刺激PMVEC 24 h后的，TNF-α分泌量分别为（253.70 ± 23.55）、（327.88 ± 37.25）、（403.20 ± 36.22） ng/L，均高于未刺激组（82.28 ± 22.56）ng/L（均P=0.000）；10 mg/L LPS刺激PMVEC后，TNF-α分泌量于1 h升高（170.11 ± 49.22）ng/L，6 h达峰值（404.82 ± 13.78）ng/L，刺激24 h后仍维持高水平（395.67 ± 36.23）ng/L，分别与未刺激组（84.60 ± 23.61）ng/L比较：P=0.001，0.000，0.000；BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激，TNF-α分泌量（200.44 ± 27.39）ng/L较LPS单独刺激（402.28 ± 31.07）ng/L显著较少（P=0.000）；与LPS单独刺激比较（407.28±32.64）ng/L，SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后，LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应（195.20±13.28）ng/L也显著下降（P=0.000）。结论 下调SSeCKS表达和蛋白激酶C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应，从而减轻PMVEC的炎症反应。

【关键词】脂多糖；肺微血管内皮细胞；肿瘤坏死因子；src抑制的蛋白激酶C底物；蛋白激酶C抑制剂；小分子干扰RNA；炎症；信号通路

Regulation of src-suppressed C kinase substrate on the expression of TNF-α in endothelial cells YOU Qing-hai， SUN Geng-yun， GAO Lei， YUE Yang， ZHANG Dan. Department of Respiratory Medicine， The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022， China.

Corresponding author：SUN Geng-yun，Email：.cn

【Abstract】Objective To study the role of src-suppressed C kinase substrate （SSeCKS） in the secretion of tumor necrosis factor （TNF-α） in rat pulmonary micro-vascular endothelial cells （PMVEC） induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods Wistar rat PMVEC cultured in vitro were randomly （random number） divided into several groups （n = 4） as per exposure to given dosage of LPS for different lengths of time and to different dosages of LPS for given length of time. After PMVEC exposed to 10 mg/L LPS for 1 hour （h）， 3 h， 6 h， 12 h and 24 h or 0.1 mg/L， 1 mg/L and 10 mg/L LPS for 24 h， the levels of TNF-αin the supernatant of culture medium were examined by the method of enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Another PMVEC was pre-treated by protein kinase C （PKC） inhibitor bis-indolylmaleimide（BIM）for 0.5 h or had the transfection of SSeCKS-specific small interfering RNA （siRNA） for 48 h before 10 mg/L LPS challenge for 24 h， and subsequently the supernatant was also examined by ELISA. One-way analysis of variance （ANOVA） was employed for statistical analysis by SPSS version 10.0 to compare values among all groups. A significant difference was presumed as a probability value < 0.05.Results After PMVEC incubated with 0.1 mg/L， 1 mg/L and 10 mg/L LPS for 24 hours， the levels of TNF-αsecreted were （253.70 ± 23.55）， （327.88 ± 37.25）， （403.20 ± 36.22）， respectively， which were higher than that in un-stimulated PMVEC （82.28 ± 22.56， all P = 0.000）. After 10 mg/L LPS challenge for one hour， the level of TNF-αin the supernatant of PMVEC raised substantially （170.11 ± 49.22）， peaked at the time of 6 h （404.82 ± 13.78）， then persisted at a higher level until 24 h （395.67 ± 36.23） than that in un-stimulated PMVEC （84.60 ± 23.61， P = 0.001， 0.000， 0.000， respectively）. After PMVEC pre-incubated with BIM， the level of LPS-induced TNF-αdecreased obviously （200.44 ± 27.39 vs. 402.28 ± 31.07， P = 0.000）.Compared with LPS challenged PMVEC （407.28 ± 32.64）， depletion of endogenous SSeCKS in PMVEC after inhibited by SSeCKS-siRNA significantly attenuated increase in the level of LPS-induced TNF-α（195.20 ± 13.28， P= 0.000）. Conclusions Down-activation of SSeCKS and PKC can inhibit the secretion of TNF-αin PMVEC induced by LPS， relieving the inflammatory response of PMVEC.

【Key words】Lipopolysaccharide； Pulmonary microvascular endothelial cells； Tumor necrosis factor； Src-suppressed C kinase substrate；Protein kinase C inhibitor；Small interfering ribonucleic acid；Inflammation；Signal pathway

急性肺损伤（acute lung injury， ALI）是失控的系统性炎症反应综合征，肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells， PMVEC）为其主要效应细胞。炎症因子诱导PMVEC通透性增加是ALI发生的关键环节，而被脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）激活的PMVEC也分泌多种炎症因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）-α、白介素（interleukin， IL）-1β和IL-6等，参与并放大PMVEC局部的炎症反应[1-4]。Src抑制的蛋白激酶C底物（src-suppressed C kinase substrate， SSeCKS）为支架蛋白，参与肺部炎症反应，多种炎症因子均可上调PMVEC表达SSeCKS，从而调控PMVEC通透性[2， 5- 6]，但其是否调控PMVEC分泌炎症因子尚未见报道。本研究体外培养大鼠PMVEC，观察SSeCKS是否调控LPS诱导PMVEC分泌TNF-α，探讨SSeCKS参与ALI的机制。

1材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Dulbecco改良Eagle高糖培养基干粉（DMEM）、特级胎牛血清及无酚红、无血清DMEM（美国，Hyclone）；内皮细胞生长辅助因子（ 美国，Upstate Biotechnology）；绵羊抗大鼠SSeCKS多克隆抗体、LPS、蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺（bis-indolylmaleimide，BIM）和异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素购自美国Sigma 公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗绵羊IgG（美国，KPL）。荧光显微镜（Olympus IX-71，日本）；Biometra梯度PCR仪（德国，Whatman）。

1.2 大鼠PMVEC分离培养及鉴定

参考文献[2， 5， 7]方法，用含15 % 胎牛血清（添加75 μg /ml内皮细胞生长辅助因子）的DMEM培养液培养分离的大鼠PMVEC。鉴定用二代细胞：细胞爬片3 ～ 6 h后、固定、与25 μg/ml异硫氰酸荧光素标记的植物凝集反应40 min，荧光显微镜观察。

1.3 SSeCKS-siRNA转染PMVEC

参考文献[2，8]，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成大鼠SSeCKS（No.AY695056）特异性小分子干扰RNA（small interfering ribonucleic acid，siRNA）双链：正义链5’-CCGAGUAGAGAAGAAUCUUtt-3’，反义链5’-AAGAUUCUUCUCUACUCGGtt-3’。普通阴性对照序列：正义链5’-AGACACUGGUUGACAAGAUtt-3’，反义链5’-AUCUUGUCAACCAGUGUCUtt-3’。转染步骤参考文献[2]。

1.4 实验分组

实验用三代细胞。①时、效量效关系：0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS分别孵育PMVEC 24 h；10 mg/L LPS孵育细胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h。未刺激组：加入无酚红培养基维持24 h；②PKC抑制剂干预：10 μmol/L BIM预处理PMVEC 0.5 h后加入10 mg/L LPS刺激24 h，设BIM、10 mg/L LPS单独刺激以及未刺激为对照；③siRNA转染：终浓度50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后加入10 mg/L LPS孵育24 h，设脂质体2000空转染、普通阴性对照siRNA转染、LPS单独刺激和LPS + 普通阴性对照siRNA转染为对照。

1.5 指标检测

1.5.1 逆转录聚合酶联反应（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）检测 mRNA表达 大鼠SSeCKS、β-actin引物序列合成及实验方法按参考文献[2， 5]进行。

1.5.2 Western blot法检测蛋白表达实验方法按参照文献[2， 5 ]进行。

1.5.3 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 检测TNF-α量提取细胞培养上清，按试剂盒说明书（R&D Systems，美国）采用双夹心ELISA检测，酶标仪（ELx808，美国，Bio-TEK）于450 nm 处检测吸光度。

1.6 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10.0 软件进行单因素方差分析或配对t检，以P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PMVEC 体外培养与鉴定

体外培养的高纯度PMVEC特征与文献[2， 5， 7 ]报道一致：原代大鼠PMVEC形态呈梭形或多边形，大小均匀，胞核清晰，单层汇合时呈鹅卵石镶嵌排列（图1A）； FITC-BSI与PMVEC结合呈明亮的黄绿色荧光（图1B）。

2.2 SSeCKS-siRNA 转染对PMVEC中SSeCKS表达的影响

50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后，RT-PCR和Western法分析SSeCKS基因和蛋白表达（n=4）：SSeCKS-siRNA转染后SSeCKS基因的表达水平约为未处理组的50%（图2A）；SSeCKS蛋白表达也显著下降，与未处理组比较：P=0.003（图2B）。You等[2]的研究已明确脂质体2000空转染和普通阴性对照siRNA转染对SSeCKS基因和蛋白表达均无显著影响。

2.3 LPS 对PMVEC分泌tnf-α 的影响

0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS分别刺激大鼠PMVEC 24 h，细胞培养上清中的TNF-α量随LPS浓度增加而升高（表1），与未刺激组比较，P值均为0.000；随刺激时间延长，PMVEC分泌TNF-α量逐渐升高：与未刺激组比较，LPS刺激1 h后TNF-α量开始上升（P=0.001），6 h达峰值（P=0.000），刺激后24 h后仍维持高水平（P=0.000），见表2。

2.4 PKC抑制剂对LPS诱导PMVEC分泌TNF-α的影响

10 μmol/L BIM预处理大鼠PMVEC 0.5 h后， 10 mg/L LPS孵育24 h，LPS诱导PMVEC分泌 TNF-α 的效应被BIM显著抑制；LPS+BIM组与LPS单独刺激组比较：P=0.000。BIM单独作用不影响PMVEC分泌TNF-α（与未刺激组比较：P=0.674）。见表3

2.5 SSeCKS对LPS诱导PMVEC分泌TNF-α的影响

见表4， 50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC后，再给予10mg/L LPS孵育24 h， ELISA法分析细胞培养上清：SSeCKS-siRNA转染+LPS刺激组的TNF-α 量较LPS单独刺激组的TNF-α量显著减少（P=0.000）；普通阴性对照转染+LPS刺激组与LPS单独刺激组比较：P=0.671。脂质体2000空转染组和普通阴性siRNA转染组与未刺激组比较，P值分别为0.879和0.965。

3 讨论

TNF-α作为诱导炎症反应的最初因子，能在细胞和亚细胞水平上激发一系列级联反应，如诱导IL-6和IL-1等炎症因子表达上调；其次，TNF-α诱导PMVEC骨架重构和细胞间缝隙形成，导致细胞通透性增加，进而形成肺水肿；此外，TNF-α还能通过激活炎症细胞，上调黏附分子和氧自由基等。所以本实验选择PMVEC分泌TNF-α作为着力点，探讨ALI的发生机制。

课题组体内研究证实LPS性ALI大鼠肺内炎症细胞聚集、肺水肿形成[9]；体外研究证实LPS与PMVEC受体结合，激活细胞内信号通路，如PKC等[6]，进而诱导ALI瀑布式炎症反应和破坏细胞屏障[6，10]。ALI启动时，TNF-α表达释放增加，既往研究已证实LPS刺激时，PMVEC也可分泌多种炎症介质[10]。本实验进一步证实LPS呈浓度和时间依赖性诱导PMVEC过度分泌TNF-α。因此，下调LPS诱导炎症因子过度表达将是治疗ALI的有效方法，但目前除了糖皮质激素，其他抗炎研究均未成功[10-11]，因此寻找新的抗炎靶点将是今后的研究热点。

研究发现PMVEC存在支架蛋白——SSeCKS，LPS上调PMVEC表达SSeCKS[6]。SSeCKS作为PKC底物，能锚定PKC、蛋白激酶A和钙调蛋白，被PKC磷酸化后，SSeCKS诱导细胞骨架重构，调控PMVEC通透性[2，5-6]。神经细胞研究发现，SSeCKS还参与炎症反应：如PKC通过SSeCKS激活丝裂原活化蛋白激酶和上调TNF-α分泌[12]；下调SSeCKS可使LPS对TNF-α和NO表达的诱导效应显著下降[13-14]。因细胞存在异质性，在PMVEC，SSeCKS是否参与TNF-α的分泌调控尚未研究。近年来，siRNA干扰以其快速、简便、高效地抑制靶基因表达倍受关注，特别是用来分析细胞信号转导通路。本研究在明确SSeCKS-siRNA能有效抑制PMVEC表达SSeCKS后，采用该技术证实：抑制SSeCKS表达可显著下调LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应，进一步研究发现，PKC特异性抑制剂也可下调LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应。因此，笔者推测SSeCKS通过以下途径参与LPS诱导PMVEC分泌TNF-α的调控：①SSeCKS作为PKC信号通路下游的效应分子，通过PKC-SSeCKS信号通路启动PMVEC分泌TNF-α；②SSeCKS作为锚定蛋白，改变PKC或蛋白激酶A活性，进而调控PMVEC分泌TNF-α。

总之，SSeCKS除了与丝状肌动蛋白关联，进而调控PMVEC通透性外[2，6]，还参与LPS诱导PMVEC分泌TNF-α的调控。参与PMVEC通透性调控和炎症因子分泌的信号通路错综复杂[4]，单纯阻断或封闭某一条或几条信号通路可能难以减轻组织损伤[15-17]，而SSeCKS可辅助信号转导相关酶在时间和空间上的协调，所以阻断SSeCKS表达或下调其活性，可达到减轻炎症反应、阻断恶性循环的目的，为治疗ALI提供新思路。

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（收稿日期：2012-06-04）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.12.012

基金项目：国家自然科学基金（81100053、81070054）

作者单位：230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院呼吸内科

通信作者：孙耕耘，Email： .cn

中华急诊医学杂志2012年12月第21卷第12期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.12

P1349-P1353