Cx43磷酸化及其与ZO-1、Src相互作用的研究进展

【关键词】 Cx43磷酸化；ZO-1；Src；缝隙连接

文章编号：1003-1383(2011)04-0496-03 中图分类号：R 33 文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2011.04.049

缝隙连接(Gap Junction， GJ)是沟通相邻细胞胞质的细胞间通道，介导缝隙连接细胞间通讯（GJIC)，缝隙连接蛋白(Connexin，Cx)是实现GJIC的结构基础，主要通过对细胞信号的传导来发挥作用。近年来随着分子生物学发展，有学者认为这种传导主要由Cx43完成［1］。在蛋白翻译后的加工中，蛋白质磷酸化是调节细胞增殖的基础，同时也是调控细胞信号转导的主要方式。研究表明，Cx43磷酸化对GJ通道的组装和决定通道传导特性起重要的作用，影响疾病的发生发展［2］。有学者对后发性心肌梗死研究发现，Cx43与Src、紧密连接蛋白-1(Zonula occludens-1，ZO-1)之间存在密切相关，它们相互作用对心肌细胞缝隙连接的结构和功能有重要影响［3］。本文对近年来Cx43磷酸化特点、磷酸化对缝隙连接通讯的影响及其与相关蛋白Src、ZO-1相互作用的研究进展进行综述。

一、Cx43磷酸化特点

Cx43是由含2768 碱基对的3条互补脱氧核糖核酸所编码的，由387个氨基酸组成的一种分子量约为43KD的磷酸化连接蛋白，包含四个跨膜区域，一个胞内环( CL)和两个胞外环（EL1-EL2 ）构成。两个二硫键连接胞外环EL1和EL2，便于对接及识别相应的连接蛋白。目前研究发现Cx43按照传统的途径合成，即转录后首先在内质网合成，然后通过细胞内运输系统，转运至高尔基复合体进行磷酸化等一系列翻译后修饰，最后在细胞膜上聚集形成GJ。其磷酸化主要发生在丝氨酸(Serine，Ser)、酪氨酸和苏氨酸等氨酸残基上，从而为Cx43的聚集和缝隙连接的形成提供保障。采用磷酸氨基酸序列分析发现，大多数的磷酸化事件发生在Cx43蛋白的丝氨酸位点［4］，而当PP60src激活时，也可以出现酪氨酸的磷酸化［5］。Cx43磷酸化区域主要是其C末端，而它在胞内袢没有丝氨酸残基，目前没有研究报道Cx43的N末端出现磷酸化。在细胞培养和组织研究中显示Cx43的半衰期较短，只有几个小时［6］，提示这么短的半衰期意味着有较高水平的转录后调控。实际上，既往有学者的研究已经发现，在稳态细胞的生命周期中Cx43 随时发生着不同的磷酸化［4，5］。在培养的成纤维细胞中研究显示Cx43 的磷酸化是发生在其抵达胞膜以前，最初的磷酸化时间出现在其合成早期的15 min内［6］。这些早期的磷酸化事件功能参与了Cx43从内质网到组装成连接子的转运过程，或者Cx43连接子从反面高尔基网络离开。在Cx43合成过程中，发现有非磷酸化Cx43形式存在，提示这些早期的磷酸化事件可能是暂时性的，或者对于其转运至胞膜不是必要的。研究表明在非细胞连接处的Cx43 并不一定进行磷酸化，但是已有大量研究证实缝隙连接处的Cx43主要磷酸化成P2形式，而且不溶于Triton X-100。这些研究表明Cx43有磷酸化和非磷酸化两种形式存在，但是主要以哪一种形式存在为主及哪一种形式功能占优势，目前尚未见有资料报道。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现，Cx43有多个电泳条带亚型，即迁移速度较快的非磷酸化的Cx43亚型(P0或者NP) 和迁移较慢的磷酸化的Cx43 亚型（P1和P2）。而用碱性磷酸酶处理后发现原P1和P2条带迁移到P0条带位置，提示Cx43磷酸化与共价修饰有关［4，5］。

二、Cx43磷酸化对缝隙连接通讯的影响

磷酸化是蛋白转录后加工的一种修饰形式，它是调控细胞信号转导的主要方式，通过蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的相互作用，控制着许多细胞内过程。Cx43是Cx蛋白家族最主要的成员之一，它存在于大多数组织细胞中，其磷酸化状态直接影响GJIC的功能。有报道表明一些植物性雌激素能抑制细胞GJIC功能，并引起Cx43的磷酸化状态的改变。Cx43磷酸化后能够影响在细胞膜上的组装、降解及GJ介导GJIC。有证据表明，Cx43一些位点的磷酸化可抑制单通道的开放，从而降低细胞间的GJ功能。有研究发现，Cx43 S368位点磷酸化，导致血管平滑肌细胞GJ通道关闭，使得通透性减弱［7］，Cx43 S368-C末端磷酸化增加，心律失常得到改善［8］，Cx43的酪氨酸位点磷酸化， GJ通道功能降低［9］。Cx43的C-末端含有多个Ser/Thr 和Tyr 残基，其中的许多位点能与其他调节蛋白相互作用，特别是其磷酸化状态受多种蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶调节，引起Cx43构象改变并最终影响GJ功能。同时，各种蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶在Cx43从生成到降解的不同阶段，包括合成(synthesis)、转运(trafficking)、聚集（assembly）/解聚(disassembly)、更新(turnover)和降解(degradation)以及通道门控(channel gating)等，直接和/或间接改变Cx43的磷酸化状态来调节GJ的功能。有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)都能够通过Cx43磷酸化反应保持半通道的关闭［10］。这些研究表明Cx43的磷酸化与GJ的功能密切相关。国内有学者采用免疫印迹技术和划痕标记示踪技术观察心肌细胞Cx43的表达和功能变化，发现异丙肾能通过兴奋心肌细胞β2肾上腺素受体，显著增强细胞间缝隙连接通道的功能，这主要与其快速诱导的心肌细胞内Cx43-NP表达的增加有关［11］。Axelsen等［12］在离体大鼠心脏体外灌流缺血实验中发现，心肌细胞Cx43羧基端第368位丝氨酸残基( Ser368)发生脱磷酸化［12］。章诗伟等［13］利用乌头碱对培养新生大鼠心室肌细胞Cx43蛋白磷酸化影响的研究中发现，心肌细胞缝隙连接通道中的Cx43蛋白在Ser368位点发生了明显的脱磷酸化。研究显示，缺血诱发心肌细胞间电耦联的失衡与Cx43广泛脱磷酸化、缝隙连接电导下降甚至通道关闭有关。因此，推测Cx43发生脱磷酸化可能也是疾病发生、发展一个重要作用机制。

三、Cx43与ZO-1、Src相互作用

ZO-1和Src是最典型的Cx43结合蛋白，它们之间相互作用对缝隙连接通道功能有重要影响，与多种疾病密切相关。ZO-1蛋白是一个220 KD的膜周边蛋白，是膜相关鸟苷酸激酶蛋白家族（membrane-associated guanylate kinase，MAGUK）的一个成员，含有PDZ 结构域、SH3 结构域和GUK结构域的复合体。通过其PDZ结构域可与其他许多细胞连接蛋白如跨膜蛋白、与肿瘤细胞的浸润和转移相关的A辅肌动蛋白-4、肌动蛋白、紧密连接相关激酶、A连锁蛋白、扣带素等相互连接，相互作用，在细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程中发挥着关键的调节作用［14，15］。最近有学者对滋养细胞层分化过程的研究发现，Cx43与ZO-1之间存在密切相关，相互作用影响GJ功能［16］。还有学者研究发现，其可通过PDZ结构域与Cx43的C端最末端氨基酸结合，引起通道开启，这与间隙连接斑的形成及稳定性有关。Src是原癌基因c-Src编码蛋白质，是一种非受体酪氨酸蛋白激酶，专一性磷酸化蛋白底物中的Tyr 残基。从N-端到C-端至依次为N端豆蔻酰基序列和膜锚定信号的SH4区、富含脯氨酸的SH3区、专一识别并结合含有磷酸化酪氨酸的SH2区、激酶区及C端调节区。有学者研究发现Src与Cx43相互作用途径，首先通过SH3区与Cx43的脯氨酸残基结合，然后SH1区磷酸化Cx43中的酪氨酸残基，再通过SH2区与磷酸化的Cx43结合，引起缝隙连接通道关闭［17］。在胞内酸中毒及化学缺血/缺氧情况等异常条件下，对GJ处的Src、ZO-1与Cx43之间的相互作用进行研究，发现高表达Cx43的原代星形胶质细胞酸中毒（pH6.5）条件下细胞间GJIC明显减少，Cx43从细胞膜向细胞浆内重新分布，而ZO-1仍然停留在细胞内膜上，同时Src与Cx43末端的结合能力增强，导致Cx43与ZO-1解离，从而引起连接通道关闭；化学缺血/缺氧条件则是因为显著诱导了Cx43 酪氨酸的磷酸化，通过与Src的SH2区结合，引起通道关闭，细胞间GJIC减少［18］。Hongwei等［19］研究发现，在高血压病晚期，ZO-1与Cx43相互作用降低，Cx43磷酸化水平下降，出现脱磷酸化，导致心肌电生理改变和心律失常。这些实验研究表明ZO-1、Src与Cx43磷酸化相互作用将对GJIC有重要影响。

综上所述，GJIC在细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程中发挥着关键的调节作用，其功能异常与多种疾病的发生、发展密切相关。Cx43磷酸化和脱磷酸化在GJ通道的转运、组装、解离、降解以及半通道和全通道的门控等起重要作用，由此影响到GJIC。Cx43与其相关蛋白ZO-1、Src的相互作用导常可引起的一些相关疾病。目前的研究来看，Cx43磷酸化及其与相关蛋白ZO-1、Src的相互作用在疾病的发生和发展中的作用机制还不是很清楚，有待于进一步研究。

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(收稿日期：2011-06-10 修回日期：2011-07-02)