HPLC法测定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A和黄芩苷的含量

摘要：分别建立了测定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A和黄芩苷含量的高效液相色谱方法。

关键词：“柴芩”注射液；柴胡皂苷A；黄芩苷；hplc

中图分类号：R284.1；O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）19-4776-03

“柴芩”注射液是四川农业大学动物医学院自主研制的纯中药注射剂，由小柴胡汤中的核心药对柴胡和黄芩两味中药配伍而成。本制剂能“清透半表之邪和清泻半里之热”，具有和解表里、疏肝解郁、扶正祛邪之功效，临床可用于急性热性病的进行期，以及伴有发热病的一般性胃病、胃肠障碍等症[1-3]。为了建立该制剂的质量标准，有效地评价其内在质量，本试验根据“柴芩”注射液的提取工艺、临床功效和有效成分[4，5]，采用高效液相色谱（HPLC）法定量检测了柴胡皂苷A和黄芩苷的含量，为有效控制其质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

黄芩苷对照品（中国生物制品检定所，批号：110715-20815）；柴胡皂苷A对照品（中国生物制品检定所，批号：110777-200406）；甲醇、磷酸（色谱纯）均购于科密欧化学试剂厂；“柴芩”注射液（20091228-20091230）由四川农业大学动物医学院药学实验室制备。

1.3 对照品溶液的配制

1.4 液相色谱条件

1.5 样品处理

1.5.1 柴胡皂苷A供试品的制备 分别量取3批“柴芩”注射液（091228-091230）以0.45 μm微孔滤膜过滤，即得柴胡皂苷A供试品；并按处方制备不含柴胡的阴性对照品，按照柴胡皂苷A供试品溶液的制备方法制成不含柴胡皂苷A的阴性样品。

1.5.2 黄芩苷供试品的制备 分别量取3批“柴芩”注射液（091228-091230）各1 mL于5个100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为黄芩苷供试品溶液；并按处方制备不含黄芩的阴性对照品，按照黄芩苷供试品溶液的制备方法制成不含黄芩苷的阴性样品。

1.6 标准曲线的绘制

1.6.1 柴胡皂苷A标准曲线的绘制 分别吸取柴胡皂苷A对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL进样，HPLC检测。每个浓度设3次重复，以柴胡皂苷A对照品含量（x）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.2 黄芩苷标准曲线的绘制 分别取吸取黄芩苷对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL进样，HPLC检测。每个浓度设3次重复，以黄芩苷对照品含量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 方法的选择性

分别吸取柴胡皂苷A对照品、“柴芩”注射液和不含柴胡皂苷A阴性样品溶液各10 μL进行分析。在柴胡皂苷A检测色谱条件下，柴胡皂苷A的保留时间为8.342 min，供试品保留时间与对照品保留时间一致，阴性样品中没有发现干扰测定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A的成分，结果见图1、图2和图3。再分别吸取黄芩苷对照品溶液、“柴芩”注射液和不含黄芩苷阴性样品溶液各10 μL进行测定，在黄芩苷检测色谱条件下，黄芩苷的保留时间为9.725 min，供试品保留时间与对照品保留时间一致，阴性样品在对照品色谱峰相应位置上无吸收峰，表明对测定无干扰，结果见图4、图5和图6。

2.2 标准曲线

2.3 精密度试验

2.4 稳定性试验

吸取柴胡皂苷A和黄芩苷供试品溶液各10 μL，分别在0、2、4、6、8 h进样，测得柴胡皂苷A峰面积RSD为1.81%、黄芩苷峰面积RSD为1.82%。结果表明供试样品在制备后8 h内稳定。

2.5 重复性试验

2.6 加样回收率试验

2.6.1 柴胡皂苷A的加样回收率 吸取1 mL柴胡皂苷A对照品溶液（0.48 mg/mL），60℃下烘干，残渣分别加入10 mL已知含量的样品溶液（091228）中，0.45 μm微孔滤膜过滤后进样10 μL。HPLC检测，连续6次，测定柴胡皂苷A的峰面积。结果显示柴胡皂苷A的平均回收率为102.60%，RSD为0.95%。

2.6.2 黄芩苷的加样回收率 吸取2.5 mL黄芩苷对照品溶液（0.46 mg/mL），60 ℃烘干，残渣分别加入5 mL已知含量样品溶液（091228）中，超声溶解后再吸取1 mL加入100 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤后进样10 μL。HPLC检测，连续6次，测定黄芩苷的峰面积。结果显示黄芩苷平均回收率为100.55%，RSD为1.69%。

2.7 样品含量测定

取3批注射液（091228-091230）按“1.5”项下方法制备供试品，每批平行制备3次。吸取对照品和供试品溶液各10 μL，按上述两个色谱条件分别进行测定，并计算各样品中的柴胡皂苷A、黄芩苷的含量。结果见表1。

3 小结与讨论

中药注射剂是在中药制剂的基础上结合现代制剂技术发展起来的新制剂，在医疗实践中发挥着重要的作用，被认为是中国未来开拓国际医药市场的优势项目[8]。由于中药注射液成分的复杂性，使得对其质量控制难度较大。为了保证临床用药的安全性和有效性，中药注射剂在确定成分含量的药味时，要以中医药理论为指导，根据药方功能，选择多指标、多成分制定测定项目，采用科学的方法建立有效成分的含量测定方法，并制定出合理的限度指标[9]。但就《卫生部药品标准》中药成方制剂中收载的注射液含量测定方法存在不完善、可控指标少甚至根本没有含量的测定的问题[10]。

高效液相色谱法已广泛地应用于中药注射剂的质量评价当中，通过指纹图谱的含量或比例，能有效控制样品的质量，确保中药注射剂工艺的科学性和质量相对稳定[11]。“柴芩”注射剂由柴胡和黄芩两味中药组成，因此选择其药效成分柴胡皂苷A和黄芩苷共同作为其质量控制指标，进行HPLC定量检测。由于两种成分吸收波长不同，且在注射剂中含量差异大，柴胡皂苷A则直接以原液进样，而黄芩苷需在稀释100倍后进样，故将二者分别检测。本试验结果表明采用HPLC法测定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A和黄芩苷的含量，方法可行、灵敏度高、重现性好、结果可靠，可有效用于该制剂的质量控制。

参考文献：

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