疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞PI3K p85α蛋白表达的影响

作者：杨钦河 欧健 孙升云 乔娜丽 程少冰 陈万群

金玲 杨环文 李娜 纪桂元 谢维宁 林秀峰 张玉佩 薛川松

【摘要】 目的 观察疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病（nafld）大鼠肝细胞磷脂酰肌醇?3?激酶p85α(pi3k p85α)表达的影响。方法 以高脂饮食12周建立大鼠nafld模型后，造模组大鼠再随机分为模型组、疏肝组、健脾组、综合组和 自然 恢复组等5组。 治疗 组分别给予相应药物灌胃，其他组给予等量蒸馏水灌胃，模型组继续高脂饮食，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主动脉取血，全自动生化仪检测血脂及肝功，稳态模型法评价胰岛素抵抗程度，光镜下观察各组肝脏病理改变，免疫组化方法检测肝细胞内pi3k p85α蛋白的表达情况。结果 与模型组相比，药物治疗各组及自然恢复组肝脏脂变程度明显减轻，肝功、血脂、胰岛素抵抗均有显著改善（p<0.05或p<0.01），肝细胞内pi3k p85α蛋白的表达明显减少（p<0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗各组肝功、血脂、血糖的改善无显著差异，但肝脏脂变程度减轻，胰岛素抵抗指数明显下降（p<0.05），肝细胞内pi3k p85α蛋白的表达显著降低（p<0.05）。结论 疏肝健脾方药对高脂饮食诱导的大鼠nafld有较好的治疗作用，其机制可能是与其降低肝细胞pi3k p85α的表达有关。

【关键词】 非酒精性脂肪性肝病 胰岛素抵抗 pi3k p85α 疏肝健脾方药

非酒精性脂肪性肝病（nafld）是目前临床上的常见病和多发病，严重影响和威胁着人们的健康。目前认为，它是遗传?环境?代谢相关性疾病，与中心性肥胖、脂质代谢紊乱、2型糖尿病等代谢综合征疾病密切相关［1］。其发病尚不能以单一的机制解释,可能为多途径、多层次损伤产生的结果，胰岛素抵抗(ir)也被认为是其重要的发病基础。以往的研究发现，疏肝、健脾方药抗脂肪肝作用的效果显著［2,3］。本实验从胰岛素抵抗方面入手探讨上述方药治疗nafld的作用效果及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

spf级雄性sd大鼠65只，购自广州中医药大学实验动物中心。实验动物许可证号：scxk（粤）2005－2004，粤监证字：2007a010，体质量（200±20）g。

1.2 实验药物

柴胡疏肝散：柴胡6 g，川芎5 g，枳壳5 g，陈皮6 g，白芍5 g，香附5 g，炙甘草3 g。参苓白术散：人参15 g，白术15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山药15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，莲子9 g，炙甘草9 g。以上方药组成、剂量均参照方剂学［4］。上述药物均为三九制药颗粒剂，购自暨南大学附属第一 医院 中药房。

1.3 饲料

基础饲料购自广东省实验动物中心，高脂饲料的组成为83%基础饲料，10%猪油，5%蔗糖，1.5%胆固醇，0.5%胆盐。

1.4 实验试剂

游离脂肪酸（ffa）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，胰岛素放免试剂盒购于 中国 原子能 科学 研究院同位素研究所，pi3k p85α一抗（兔抗大鼠）及二抗工作液（羊抗兔igg）购于武汉博士德生物技术公司。

1.5 动物分组与模型建立

大鼠正常喂养1周后，随机分为正常组（10只）、造模组（55只）。正常组给予基础饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养。12周后，随机抽取造模组5只，取肝组织做病理检测。鉴定造模成功后，将造模组随机分为模型组、疏肝组(柴胡疏肝散)、健脾组(参苓白术散)、综合组（柴胡疏肝散合参苓白术散）、自然恢复组，每组10只，用药组灌药剂量据《 现代 医学实验动物学》［5］确定，其余各组均给予等量蒸馏水灌胃，同时除模型组继续高脂饮食外，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，各组动物于末次给药后,禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，经腹主动脉取血，分离血清，迅速摘取肝脏，取相同部位肝右叶组织用多聚甲醛溶液固定。

1.6 指标检测

1.6.1 生化指标 用全自动生化检测仪检测血清alt、ast、tc、tg、ldl?c、hdl?c、glu、apob100，用ffa检测试剂盒检测血清ffa，血清胰岛素的测定采用放射免疫法。胰岛素抵抗指数（homa?ir）=空腹胰岛素（μu/ml）×空腹血糖（mmol/l）/22.5， 计算 值取自然对数变换。

1.6.2 组织病 理学 检查 取固定液固定的肝组织，大小约2 cm×2 cm×0.3 cm，常规石蜡包埋，切片，he 染色，光镜下观察肝脏组织学变化。

1.6.3 肝细胞内pi3k p85α的检测 肝组织石蜡切片用免疫组化（sabc法）方法检测pi3k p85α在肝细胞中的表达及分布情况。

1.7 统计学方法

计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，pi3k p85α阳性率的比较用χ2检验及fisher’s确切概率检验。 p＜0.05有统计学意义。所有数据均采用spss13.0统计软件进行统计分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血清tc、tg、hdl?c、ldl?c的变化

与正常组相比，模型组tc、tg、ldl?c较正常组显著升高（p＜0.01），hdl?c显著降低（p＜0. 05）；与模型组相比，各药物治疗组及自然恢复组均显著降低tc、ldl?c（p＜0.01）及tg（p＜0. 05），升高hdl?c（p＜0.05），提示调整饮食结构可能对nafld的早期具有重要意义。见表1。

2.2 各组大鼠血清alt、ast、ffa和apob100的变化

与正常组相比，模型组alt、ast、apob100均显著升高（p＜0.01），ffa明显增加（p＜0.05）；与模型组相比，药物治疗组及自然恢复组alt、ast、ffa均显著降低（p＜0.01，p＜0.05）；药物治疗各组apob100显著降低（p＜0.01），提示疏肝健脾方药可能对脂质代谢具有进一步的潜在作用。见表2。

2.3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化

与正常组比较，模型组血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高（p＜0.05）。与模型组相比，各用药治疗组及自然恢复组均可显著降低血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数（p＜0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗组胰岛素、胰岛素抵抗指数均有明显降低（p＜0.05），提示所造大鼠nafld模型存在ir。见表3。

表1 各组大鼠血脂的变化（略）

table 1 comparison of the levels of blood lipid in different groups

与正常组相比:*p＜0.05, **p＜0.01；与模型组相比:p＜0.05，p＜0.01

表2 各组大鼠肝功、ffa和apob100的变化（略）

table 2 comparison of the levels of serum alt, ast, ffa and apob100 in different groups

与正常组相比:*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组相比:p＜0.05，p＜0.01

表3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化（略）

table 3 comparison of fps, insulin and insulin resistance index in different groups

与正常组相比:*p＜0.05；与模型组相比:p＜0.05；与 自然 恢复组相比:p＜0.05

2.4 各组大鼠肝组织学变化

大体观察：模型组大鼠肝脏体积明显增大，包膜紧张，色泽较正常组暗淡，整体呈苍黄色，可见局灶黄白色变性灶，质地偏硬，切面油腻。其他各组大鼠肝体积均有不同程度的增大，呈淡黄褐色，质地、弹性和韧性均较正常组略差。其中，疏肝组、健脾组、综合组要好于自然恢复组。

光镜下正常组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐。模型组大鼠肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，肝窦消失，出现弥漫性脂肪变性，胞浆中可见大小、数量不一的脂滴空泡，甚者脂滴互相融合，将胞核挤向一侧；小叶内炎症较重，部分大鼠可见数个炎症坏死融合成片。

疏肝组、健脾组、综合组病理改变大致相同，表现为肝细胞轻度脂肪变。自然恢复组大鼠肝组织脂肪变程度较模型组明显减轻，但不如其他药物 治疗 组改善明显。

2.5 各组大鼠肝细胞pi3k p85α蛋白表达及分布情况

2.5.1 pi3k p85α的免疫组化结果 正常组大鼠肝细胞内pi3k p85α表达很少，阳性表达率低；模型组大鼠肝细胞内pi3k p85α的表达强，阳性细胞染色呈黄褐色，主要分布于脂肪变的肝细胞膜和胞浆内，阳性表达率高达90%；其他各组pi3k p85α表达强度依次为自然恢复组＞综合组＞健脾组＞疏肝组，其中药物治疗组染色强度相似，主要分布在脂肪变肝细胞的阳性细胞率逐渐降低。与正常组相比，模型组pi3k p85α表达显著增多（p＜0. 05）；与模型组比较，各药物治疗组pi3k p85α表达显著减少（p＜0.05），以疏肝组pi3k p85α表达降低最明显，自然恢复组pi3k p85α表达也降低，但差异无统计学意义，提示疏肝健脾方药有显著抑制pi3k p85α表达的作用。见表4及图1。

表4 各组大鼠肝细胞pi3k p85α表达比较（略）

table 4 comparison of the expression of pi3k p85α in hepatocyte in different groups

与模型组相比:*p＜0.05

a.正常组（×400）;b.模型组（×400）;c.疏肝组（×400）;d.健脾组（×400）;e.综合组（×400）;f.自然恢复组（×400）

图1 各组大鼠肝细胞pi3k p85α的表达情况(sabc法)（略）

figure 1 the expression of pi3k p85αprotein in hepatocyte in different groups

2.5.2 pi3k p85α的表达与病理分级的关系

χ2检验相关分析表明，pi3k p85α在各组中的表达强度与其病理分级存在正相关（相关系数r=0.671，p=0.000），提示肝组织脂肪变性程度越严重pi3k p85α的表达越强，二者存在明显的相关性。见表5。

表5 肝组织脂肪变性程度与pi3k p85α表达的相关性（略）

table 5 correlation between degree of liver steatosis and expression of pi3k p85α

3 讨论

nafld是遗传、环境、代谢因素所致肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。大量流行病学资料显示，nafld与肥胖、2型糖尿病(t2dm)、血脂异常等代谢综合征相关疾病密切相关。由于ir是代谢综合征的“共同土壤”［6］，故而推测ir可能也是nafld的发病基础。最近研究表明，几乎所有的nafld患者都存在周围组织和肝脏的ir ［7］，且ir的严重程度与nafld的病情进展相关［8,9］。

研究表明高脂环境诱导的ir伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常［10,11］。肝细胞内的胰岛素信号转导通路主要是pi3k信号通路，胰岛素受体后信号转导通路异常是导致ir的最主要的原因。pi3k的改变与ir密切相关。pi3k是脂质激酶的一种，在介导胰岛素刺激的糖代谢反应过程中具有重要的作用。pi3k是由一个分子量85 kda的调解亚基（p85）和一个分子量110 kda的催化亚基（p110）组成的异二聚体复合物。p85α是p85表达最丰富的一个亚基。过度表达的pi3k p85亚基能够竞争性抑制p85?p110二聚体与胰岛素受体底物1（irs?1）的结合，从而抑制pi3k的活性［11,12］。相反，部分抑制p85亚基表达，提高p85?p110二聚体/ p85单体的比例可以改善pi3k介导的胰岛素信号转导［13］， p85α过度表达是营养诱导ir发病机制中一个早期分子步骤［14］。在本实验中，模型组大鼠肝组织中pi3k p85α蛋白的表达明显高于正常组，因此可认为，p85α的表达增多，导致p85与p110比值明显增加，使pi3k的活性下降，从而导致ir的发生，进而引起全身脂质代谢紊乱，脂肪在肝脏的堆积增加。本实验研究表明，模型组大鼠肝指数、肝功、血脂、血糖、胰岛素及ir指数显著升高，说明高脂饮食20周诱导的nafld模型存在严重的糖脂代谢紊乱，并出现了ir，与 文献 报道的结果一致［15］。

与控制高脂饮食治疗相比，疏肝健脾方药联合控制高脂饮食方案治疗nafld，对血脂、肝功、血糖的改善作用无明显提高，但在改善ir程度及肝组织病理方面，疏肝健脾方药显示出了良好的作用，其效果明显优于单纯的控制高脂饮食，且其可明显减少肝细胞pi3k p85α蛋白的表达。笔者认为，控制饮食结构的治疗可通过降低血脂、血糖来减轻甚至消除ir，若肝损伤只停留在单纯性脂肪肝阶段，去除外部损伤因素后，肝脏有较强的自身调节、自我恢复的作用；但是疏肝健脾方药能显著减少肝细胞pi3k p85α蛋白的表达，改善ir，说明在nafld的中早期，通过控制高脂饮食固然可以降低血糖、血脂，但其改善胰岛素抵抗未起到根本性的作用，疏肝健脾法及其方药能针对胰岛素抵抗的发病机制，充分发挥中医整体综合治疗的优势，以达到改善ir、增加胰岛素敏感性的目的，其具体的作用机制值得进一步研究。

中医学认为肝失疏泄,气机不畅,或脾不健运,水湿内停,湿热内蕴,痰浊郁结,痰瘀阻滞,最终形成湿浊痰瘀互结,痹阻肝脏脉络而形成本病。可见肝郁脾虚是发病的内在基础,湿浊痰瘀为主要病理因素，本虚标实为其病机特点，肝郁脾虚的病机贯穿于nafld发病过程的始终［16］。研究发现，肝气郁滞以及在脾虚的基础上，水湿、痰浊、瘀血内生，是ir产生的主要病理机制［17］。根据以方测证的原理，所造大鼠nafld模型的中医证候应属肝郁脾虚向痰湿内阻进而痰瘀互结阶段转化，其证候究竟是如何 发展 转化的，尚需进一步探讨。

【 参考 文献】

［1］ tarantino g, saldalamacchia g, conca p, et al. non?alcoholic fatty liver disease: further expression of the metabolic syndrome［j］.gastroenterol hepatol,2007,22 (3):293-303.

［2］ 杨钦河,周迎春,郭桃美,等. 不同治法方药对脂肪肝大鼠血脂作用的比较研究［j］.新中医,2004, 36（5）:74-75.

［3］ 孟民杰, 杨钦河, 王　强, 等. 不同治法方药对大鼠脂肪肝kupffer细胞erk1 /2蛋白活性的影响［j］.