绞股蓝多糖对小鼠胸腺和脾脏影响的研究

摘要：采用原位末端标记（TUNEL）、过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒（SP）技术，观察绞股蓝多糖对小鼠胸腺、脾脏淋巴细胞凋亡和增殖的影响。结果发现各组胸腺和脾脏中均可见凋亡的淋巴细胞，细胞胞核染色质固缩凝聚，有的形成凋亡小体。统计分析表明，50 mg/kg的绞股蓝多糖能促进胸腺和脾脏淋巴细胞的增殖和凋亡，推论可知其可以促进胸腺和脾脏淋巴细胞的更新。

关键词：绞股蓝多糖；小鼠胸腺；脾脏；细胞凋亡；细胞增殖

中图分类号：R967 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4156-05

The influence of Gynostemma Polysaccharide on the Spleen and Thymus of Mouse

ZHOU Shi-qiong1，LU Jun-qiu2，LI Gui-zhi2，ZHOU Yue2，WEI Xiao-rui2，WANG Xiao-li2

（1.Dalu Veterinary Station of Bishan， Bishan 402772，Chongqing，China；

2.College of Animal Science and Technology， Guangxi University，Nanning 530005，China）

Abstract： The influence of gynostemma polysaccharide on lymphocyte apoptosis and proliferation of the spleen and thymus was detected by TUNEL and SP. The results showed the apoptosis cells were found in all groups of spleen and thymus， chromatin of the cell nucleus were pyknosis and cohesion， and some even formed the apoptotic body. The statistical analysis showed that 50 mg/kg gynostemma polysaccharide could promote the lymphocyte proliferation and apoptosis of the spleen and thymus. It indicated that the Gynostemma polysaccharide could provoke the renew of the spleen and the thymus lymph cell on physiological status.

Key words： gynostemma polysaccharide； thymus； spleen； cell apoptosis； cell proliferation

收稿日期：2013-03-29

基金项目：广西大学动物科学技术学院科研发展基金项目（DK201102）；2011年新世纪广西高等教育教改工程项目（2011JGB006）；广西高等

学校特色专业及课程一体化建设项目（GXTSZY141）

作者简介：周石琼（1985-），女，四川巴县人，助理兽医师，硕士，主要从事组织胚胎学的研究，（电话）18983283859（电子信箱）；

通讯作者，王晓丽（1976-），女，内蒙古赤峰人，教授，主要从事细胞、组织与胚胎工程的研究，（电子信箱）。

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum），又名七叶胆、甘茶蔓等，味苦、性寒、无毒。主要分布于中国南部，在广西有丰富的资源。绞股蓝具有抗疲劳、抗缺氧、减肥、抗衰老、抗溃疡作用，并有抑制癌细胞增殖和胆结石形成的功效[1-4]。近年来的研究表明，绞股蓝多糖具有非常重要的生物活性，在世界范围内已经对绞股蓝多糖的提取和其药用价值进行了全面的研究，特别在其免疫效果的研究方面。但是大多数研究是就临床效果进行脏器指数统计或是进行体外细胞培养从而验证其免疫能力，而没有从体内的细胞学角度进行研究。本试验对小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡和增殖进行了研究，从组织学角度研究绞股蓝多糖对小鼠免疫系统的影响，从而验证绞股蓝多糖的免疫性能，为其开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组情况

健康昆明种小白鼠40只，购于广西医科大学实验动物中心，雌雄各半，体重18.00～22.00 g。随机分为4组，每组10只，于实验动物房标准鼠笼中饲养，自由采食、饮水，其他管理措施参照小鼠饲养管理手册。其中1组为对照组，另外3组为试验组。试验组小白鼠分别注射不同浓度（50、100、200 mg/kg）的绞股蓝多糖，每天腹腔注射0.5 mL/只，连续给药7 d，对照组则注射等体积生理盐水。各组动物于末次给药后24 h脱臼处死，取胸腺和脾脏称重记录后分别进行固定。

1.2 药品与试剂

绞股蓝多糖：于广西大学动物科技学院药理实验室提取；细胞凋亡原位检测试剂盒（In Situ Cell Death Detection Kit，POD）：Roche Applied Science，Cat.No.11 684 817 910；细胞增殖检测试剂盒：中衫金桥（ZSGB-BIO）SP-9000/9001/9002 HistonstainTMPlis Kits；DAB试剂盒：中衫金桥（ZSGB-BIO）ZLI-9031/9032/9033；小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原单克隆抗体：中衫金桥（ZSGB-BIO）ZM-0213。

1.3 试验方法

绞股蓝多糖含量测定：采用苯酚硫酸法。将绞股蓝多糖0.1 g溶于1 000 mL的蒸馏水中，取2 mL溶液加入6%的苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀，室温放置20 min后于490 nm处测得吸光度值。以标准曲线计算得多糖含量。

脏器指数：小鼠脱臼处死后取其胸腺、脾脏，用滤纸吸干水分后即在分析天平上称重，计算脏器指数。胸腺指数=胸腺重/体重；脾脏指数=脾脏重/体重。

胸腺、脾脏石蜡切片制作：梯度乙醇脱水、二甲苯∶乙醇（1∶1）浸透、二甲苯透明、石蜡包埋、修块、切片（5 μm）、载玻片涂抹甘油蛋白捞片、50 ℃烘箱放置48 h。

原位末端标记（TUNEL）法试剂盒检测：切片用二甲苯清洗2次，梯度乙醇复水，PBS漂洗2次，细胞通透液8 min，PBS漂洗2次，于暗湿盒中37 ℃孵育30 min，PBS漂洗2次，于组织处加50～100 μL DAB底物，15～25 ℃反应10 min，PBS漂洗2次，苏木精复染几秒钟后用自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜观察，随机选取10个视野，分别计数视野内的凋亡细胞数，求平均值并进行统计学分析，拍照。

SP试剂盒检测：石蜡切片常规脱蜡至水，去离子水反应10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min，滴加试剂A（蓝）于室温下10～15 min，倾去，勿洗；滴加1∶100稀释的一抗于37 ℃孵育2～3 h ，用PBS清洗3次，每次3 min；滴加试剂B（黄）于37 ℃孵育10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；滴加试剂C（橙）于37 ℃孵育10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；用 DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察，随机选取10个视野 ，分别计数视野内的增殖细胞数，求平均值并进行统计学分析，拍照。

1.4 统计学分析

采用SPSS18.0 for windows 统计学软件进行方差分析，计量数据用“平均数±标准差”表示，比较各组细胞凋亡率的差异。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝多糖含量测定

通过苯酚硫酸法测定样品吸光度为0.47。通过图1中标准曲线和回归方程计算得其多糖含量为83.4%。

2.2 绞股蓝多糖对小鼠脏器指数的影响

由表1可见，50 mg/kg和100 mg/kg绞股蓝多糖对正常小鼠的脾脏指数有抑制作用，与空白对照相比差异极显著（P

2.3 染色结果

HE染色：可见正常淋巴细胞核染色呈蓝色或紫色，染色质色泽均一。凋亡细胞胞核染色质固缩、边集，呈花瓣状、半月形或凋亡小体（图2、图3）。

原位末端标记（TUNEL）法检测结果：视野内可见大量的TUNEL阳性细胞，其细胞核呈棕黑色，胞质为均匀的棕黄色；周围正常细胞的细胞核呈米黄色（图4、图5）。

SP检测结果：可见阳性细胞胞核呈棕色，凸显于视野中，胞质匀染；周围阴性细胞呈黄色，胞质均匀淡黄色（图6、图7）。

2.4 绞股蓝多糖对小鼠脾脏和胸腺淋巴细胞凋亡的影响

由表2可见，在小鼠生理状态下，50 mg/kg和200 mg/kg的绞股蓝多糖对小鼠脾脏淋巴细胞凋亡有促进作用，与空白对照和100 mg/kg组相比差异极显著（P

2.5 绞股蓝多糖对小鼠脾脏和胸腺淋巴细胞增殖的影响

由表3可见，50 mg/kg和100 mg/kg的绞股蓝多糖都能够使脾脏淋巴细胞增殖增加，结合表2分析可知，绞股蓝多糖能够增加脾脏的代谢，增强脾脏细胞的更新。而50、100、200 mg/kg的绞股蓝多糖对小鼠胸腺淋巴细胞的增殖均有显著的影响（P

3 小结与讨论

胸腺是机体最重要的淋巴器官，其功能与免疫紧密相连，其最主要的功能是产生T淋巴细胞，因此其功能状态是否正常就直接影响到机体免疫状况的好坏。而脾脏是机体中最大的淋巴器官，占全身淋巴组织质量的1/4，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，在异物入侵的时候可起到过滤的作用，在缺血的时候可起到补血的作用，在肿瘤发生的时候可起到抗肿瘤的作用，所以对其细胞状况的观察也是对机体免疫功能好坏评估的一种重要手段。本试验是基于胸腺和脾脏在机体免疫中具有的重要地位而选取其作为免疫指标来对绞股蓝多糖的免疫效果进行检测。

对于生理状态下多糖对机体免疫功能影响的研究已有很多，从植物多糖到动物多糖，其大多都具有免疫刺激的功能，并且在生理状况下对细胞的凋亡和增殖同样有影响。文贵辉等[5]在樱桃谷鸭的饲料里加入了白术多糖，再检验其细胞增殖的状况，结果表明添加白术多糖的樱桃谷鸭细胞显著增殖，而对其胸腺指数没有显著影响，脾脏指数在添加比例为0.6%时有显著抑制作用。尚川川等[6]将淫羊藿多糖作为一种免疫佐剂用于鸡新城疫的预防，通过免疫器官的指数测定，得出中剂量和高剂量的多糖对脾脏指数有促进作用。廉宜君等[7]从中药方剂中提取出了复合多糖，并且对其免疫功能进行研究，得出该复合多糖能够显著提高脾脏指数和胸腺指数，并且与黄芪多糖组比较也存在显著差异。董兰凤等[8]对附子多糖的抗肿瘤作用研究得知其能够明显增大小鼠脾脏的质量，能够诱导肿瘤细胞的凋亡。王守山等[9]通过对芦荟多糖的研究指出其能够促进胸腺和脾脏的发育，特别是能促进胸腺的发育。樟芝多糖对小鼠的胸腺和脾脏指数都有显著的影响，特别是高剂量组，而且其还能够促进淋巴细胞的增殖，并呈现了剂量和效应的关系[10]。左旋咪唑党参多糖能够显著提高雏鸡的胸腺和脾脏指数，而且能够使淋巴细胞显著增殖，并且在高剂量时表现最为显著[11]。在鬼臼多糖的研究中，通过不同浓度的鬼臼多糖与脾脏淋巴细胞的混合培养，用MTT法测得其增殖情况证明鬼臼多糖对淋巴细胞的增殖有促进作用[12]。王烨等[13]对海藻多糖进行研究，将其添加于水中让肉杂鸡饮用，观察其对免疫性能的影响，结果表明其能显著提高肉杂鸡免疫器官的系数，特别是脾脏指数，也可提高血淋巴细胞数量，证明其能增强肉杂鸡的免疫功能。王媛媛[14]通过流式细胞仪和TUNEL等方法对吉西他滨、人参多糖进行研究，得知其能够抑制人A549细胞的增殖，通过Bcl-2的下调，表现为细胞G0/G1期的阻滞，从而使细胞产生凋亡，进而达到抑制肿瘤的作用。孙延庆等[15]通过形态学和流式细胞仪等方法研究梁金菇多糖，得知其在一定的剂量内具有诱导原代白细胞凋亡的作用。裙带菜多糖对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用十分明显，高浓度的肿瘤抑制率可以达到69.13%，其淋巴细胞的杀瘤活性与对照组相比差异显著，而在体内的抗Hca-F转移模型中，裙带菜多糖对转移模型小鼠肿瘤细胞生长的抑制作用也很显著，而且在流式细胞仪及免疫细胞化学分析下可知该多糖有很强的诱导细胞凋亡的作用[16]。茯苓多糖、猪苓多糖和黄芪多糖都能影响细胞内的钙离子浓度，但是其作用时间和剂量没有一定的相关性，通过对钙离子浓度的影响，从而诱导细胞的凋亡[17]。对三种昆虫多糖的研究表明其通过静脉注射能够提高免疫性能[18]。猪胎盘脂多糖能够使体外培养的淋巴细胞的DNA和蛋白质的合成加强，促进淋巴细胞显著增殖，在48 h时效果最为显著[19]。绞股蓝多糖对接种肝癌Heps的小鼠肝脏和胸腺没有影响，但是对接种肉瘤S180的小鼠的脾脏有显著刺激促进作用，而对两种小鼠的淋巴细胞的转化都没有显著影响[20]。绞股蓝多糖能够对环磷酰胺处理过的小鼠淋巴细胞的增殖产生强烈刺激作用，说明其对免疫抑制小鼠的细胞免疫功能具有促进作用[21]。

在本试验中研究了绞股蓝多糖对生理状况下小鼠胸腺及脾脏的影响。在脏器指数方面，绞股蓝多糖各剂量对小鼠的胸腺指数没有影响，而对脾脏有刺激作用，在低、中浓度的时候是抑制脾脏的生长，使其指数降低，高浓度的时候则有促进作用。在细胞凋亡方面，低、中浓度的绞股蓝多糖可使胸腺淋巴细胞的凋亡数增加，低、高浓度的胶股蓝多糖可使脾脏淋巴细胞的凋亡数增加。同时，低、中浓度的绞股蓝多糖对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖有促进作用，而低、中、高浓度的绞股蓝多糖均可促进小鼠胸腺淋巴细胞的增殖。综合分析可知绞股蓝多糖既能促进胸腺和脾脏的细胞凋亡也可促进其增殖，即促进了胸腺和脾脏细胞的更新。

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