魔芋内生拮抗菌的定殖研究

摘要：采用抗魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）软腐病的内生芽孢杆菌BS-8发酵液灌根魔芋植株，定期测定该内生拮抗菌在魔芋叶片中的定殖情况。根据该内生菌16S rRNA特异性保守区域设计引物，定期4次采样，提取魔芋叶片DNA，通过SYBR Green I实时荧光定量PCR法检测该内生拮抗菌在魔芋叶片中的定殖情况。结果表明，经内生拮抗菌灌根培养的魔芋叶片中芽孢杆菌数量均明显大于对照，该内生芽孢杆菌能大量定殖在魔芋叶片中。

关键词：魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）软腐病；内生拮抗菌；SYBR Green I实时荧光定量PCR

中图分类号：S632.9；TQ458 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0613-04

魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）软腐病是由胡萝卜软腐欧文氏杆菌（Erwonia carotovora var. Carotovora）引起的一种细菌性病害[1]。该病原菌致病机理为病原菌分泌果胶酶，消解细胞中间层，使组织溃烂，吸引其他腐败细菌寄生，分解细胞蛋白胨，产生吲哚[2]。可危害所有十字花科蔬菜，且可交替传染。在流行年份损失可达50%～60%，甚至绝收，因此对其进行防治十分必要[3]。

近年来，生物防治已成为国内外学者的研究热点[4]。生物防治有利于人畜安全及环境保护，它不仅成本低廉，且兼防兼治，可增产增收，是一种无公害植保新技术，倍受人们青睐[5]。植物内生菌是指在植物生长的一定或全部阶段生活在植物体内、但不表现出外在性状的一类微生物，通常存在于细胞间隙[6，7]。植物内生菌作为生防因子的优势主要表现在它能定殖于植物体内，相对于其他环境微生物而言，避免了多种外界压力的干扰，更有利于发挥生防效果。关于魔芋内生菌定殖体内的生防效果研究很少，因此，筛选出具有拮抗魔芋软腐病的微生物是目前防治软腐病的有效途径。

实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR）技术是通过在反应体系中添加荧光染料或荧光标记特异性探针，在PCR反应过程中对扩增产物进行实时在线监控，通过收集的荧光信号强弱进行定性或定量检测和分析[8-10]。与常规PCR相比，荧光定量PCR能准确确定初始模板的拷贝数或浓度，灵敏度高，其扩增产物无需进行琼脂糖凝胶电泳，大大提高了试验效率。利用实时荧光定量PCR技术能对植物样品进行定性和定量检测，主要用于研究植物体内有益微生物及病原菌的定量检测、基因拷贝数检测、目的基因表达水平差异检测等，检测范围为101～1010拷贝数。本研究利用实时荧光定量PCR技术检测内生拮抗菌在魔芋植株中的定殖情况，以期为研究新的魔芋生防制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试灌根用菌为魔芋内生拮抗菌芽孢杆菌BS-8，由三峡大学生物技术研究中心于2011年分离鉴定并保存，经鉴定该菌抗魔芋软腐病。培养基为LB培养基[11]。

1.2 方法

1.2.1 发酵液的制备 将BS-8菌种涂布于LB固体培养基的平板上，置于37 ℃培养箱中过夜培养。挑取一定体积的菌落置于含250 mL LB液体培养基的锥形瓶中，封口后放入摇床，37 ℃振荡培养48 h。检测发酵液OD值，使其OD值为0.6，以备后面灌根用。

1.2.2 DNA的提取 挑取大小均匀、质量约10 g的种芋播种于花盆中，待出苗后，以每盆100 mL内生拮抗菌发酵液浇灌于魔芋植株根部，以浇灌自来水的作为空白对照，每个处理20个重复。待魔芋灌根处理后每隔15 d采1次样，共采样4次，样品和空白对照每次做3次重复。DNA的提取采用CTAB法[12]。

1.2.3 引物设计与PCR检测 将该内生拮抗菌16S rRNA序列与同属菌株进行比对，寻找特异性区域，根据该区域设计引物。上游引物为FQ-5 5′-ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAG-3′和下游引物为FQ-3 5′-TCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCC-3′，PCR扩增产物为147 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1）构建质粒标准品。以BS-8菌株的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系（25 μL）为DNA模板 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Primer 1和Primer 2各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。反应条件为94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃保温10 min。扩增产物经电泳检测，割胶回收后连接T载体，并将阳性转化子菌液送至生工生物工程（上海）有限公司测序。

2）标准品和待测样品的实时荧光定量PCR。反应体系（25 μL）：DNA模板2.0 μL，Primer 1和Primer 2各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 12.5 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，78 ℃ 孵育1 s，共39个循环；72 ℃保温10 min。反应结束后，对PCR产物进行检测，温度从60 ℃上升到95.5 ℃，直至PCR产物全部解链，温度上升的幅度为0.3 ℃/s，每10 s检测一次荧光信号，绘制PCR产物的溶解曲线、扩增曲线图和标准曲线。

3）SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR标准曲线的绘制。以纯化后的质粒作为标准品，用核酸蛋白测定仪检测提取的质粒浓度，计算其拷贝数[13]。

将质粒标准品稀释成10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4 ng/μL 6个浓度梯度，拷贝数范围在105～1010copies/μL之间，以这6个浓度的质粒DNA进行荧光实时定量PCR，制作标准曲线，每个浓度3次重复，同时以不加模板作为阴性对照。反应结束后，自动生成溶解曲线，并根据不同浓度标准DNA的Ct值及其起始拷贝数的log值绘制标准曲线，建立标准曲线的线性范围，构建绝对定量。

4）内生拮抗菌BS-8在魔芋体内定殖情况的检测。以4次定期采样的样品和空白魔芋叶片总DNA为模板进行荧光定量PCR检测，反应体系和条件同上，反应结束后，将每个模板对应的Ct值代入标准曲线的方程中，计算内生拮抗菌的log值，并换算成芽孢杆菌数量。

2 结果与分析

2.1 常规PCR检测内生拮抗菌在魔芋叶片中的定殖情况

利用内生拮抗菌芽孢杆菌16S rRNA特异性保守区域序列设计引物FQ-5和FQ-3，以芽胞杆菌灌根处理的魔芋叶片总DNA为模板进行PCR扩增，同时以未灌根的魔芋叶片总DNA为空白对照，2%琼脂糖电泳检测扩增产物。如图1所示，接种后魔芋叶片DNA的PCR产物在150 bp左右有一条亮带，条带清晰，与预期的条带大小一致；未接种魔芋叶片DNA的PCR产物除第三次外均无此条带。结果表明，常规PCR检测到经芽孢杆菌BS-8灌根处理的魔芋叶片中含有芽孢杆菌，与空白对照相比，初步确定该芽孢杆菌BS-8能定殖在魔芋体内。该内生拮抗菌在空白处理魔芋叶片中也有一定量的表达。

2.2 质粒标准品的构建

以芽孢杆菌BS-8的DNA为模板进行PCR扩增，结果如图2所示。在150 bp处有一条清晰的条带，与预期的条带大小一致，PCR产物特异性强、条带清晰，没有明显的二聚体产生。将扩增的目标片段与T载体连接，测序结果得到序列大小为147 bp。

2.3 实时荧光定量PCR标准曲线的绘制

利用构建好的标准质粒DNA（浓度梯度分别稀释为10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3及1×10-4 ng/μL）进行实时荧光定量PCR，溶解曲线、扩增曲线和标准曲线依次见图3、4和5。由图3可知，溶解曲线只有单一峰，说明反应过程中没有其他非靶标产物产生，引物特异性强，产物的溶解温度Tm值惟一，温度为84.3 ℃，定量准确。

由图5可知，标准曲线的斜率为-3.216 66，说明反应的Ct值与质粒浓度的拷贝数log值成反比，实时荧光定量PCR标准曲线的R2=0.980 82，说明不同拷贝数与其对应的Ct值具有很高的相关性，准确性好，能用于后续进一步的荧光定量分析。

2.4 内生拮抗菌的定殖情况

将灌根处理的魔芋叶片的总DNA稀释成相同浓度（10 ng/μL）作为模板进行实时荧光定量PCR，荧光扩增曲线如图6所示。将魔芋总DNA反应的Ct值代入标准曲线方程中，计算芽胞杆菌DNA拷贝数的log值，并换算出每克魔芋叶片中含有的芽胞杆菌数量。

2.5 检测结果

由表1可知，利用Ct值代入标准曲线方程中计算出的拷贝数范围在108～109 copies/μL之间，符合定量标准曲线105～1010 copies/μL的线性范围，经芽胞杆菌灌根接种的魔芋叶片中芽胞杆菌数量均明显大于空白处理。

3 结论

本试验通过实时荧光定量PCR检测了魔芋内生拮抗芽孢杆菌BS-8在魔芋叶片中的定殖情况。但是该数据不能说明该内生拮抗菌与抗魔芋软腐病之间有直接关系，因此，需要后面继续进行研究，检测该内生拮抗菌在魔芋块茎和叶柄中的定殖情况及与抗软腐病之间的关系。另外，该定量方法并不能说明所检测的内生菌数量全部是芽孢杆菌BS-8，因为魔芋叶片的DNA 包括魔芋自身的，也包括大量微生物的，也就是说荧光定量PCR检测的定殖芽孢杆菌含量并不准确，因为荧光定量PCR并不能进行物种分类，包含有此特异的16S rRNA引物的微生物都会被检测到，单纯的16S rRNA引物并不能用来对特异的某种微生物进行准确定量分析，尤其在比较复杂的微生物体中，如果要进行更精确的分析，应采用探针法进行研究。

参考文献：

[1] 李雅华，咸洪泉，李树文，等.拮抗胡萝卜软腐欧文氏杆菌的放线菌的分离和筛选[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2009， 26（2）：143-146.

[2] 翁祖信.蔬菜病虫害诊断与防治[M].天津：天津科学技术出版社，1994.363-365.

[3] 陈 丽，安德荣，张钰铭.防治白菜软腐病的药剂筛选[J].西北农业学报，2005，14（2）：105-107.

[4] 薛 婷，李喜宏，陈 丽，等.蒜苔采后灰霉病害及生防拮抗菌的筛选研究[J].食品科学，2006，27（6）：220-222.

[5] 姜 钰，董怀玉，徐秀德，等.放线菌在植病生防中的研究进展[J].杂粮作物，2005，25（5）：329-331.

[6] SCHMEDA-HIRSCHMANN G，HORMAZABAL E，RODRIGUEZ J A，et al.Cycloaspeptide A and pseurotin A from the endophytic fungus Penicillium janczewskii[J]. Z Naturforsch，2008，63（5/6）：383-388.

[7] AZEVEDO J L，ARAUJO W L.Diversity and applications of endophytic fungi isolated from tropical plant[A]. In Fungi：Multifaceted Microbes[C]. New Delhi： Anamaya Publishers，2007. 189-207.

[8] KUBISTA M， ANDRADE J M，BENGTSSON M，et al. The real-time polymerase chain reaction[J]. Molecular Aspects of Medicine，2006，27（2/3）：95-125.

[9] 韩彩霞，赵德明，吴长德，等.用实时荧光定量RT-PCR方法定量绵羊PrP基因的表达[J].中国农业大学学报，2006，11（2）：61-64.

[10] 欧阳松应，杨 冬，欧阳红生，等.实时荧光定量PCR技术及其应用[J].生命的化学，2004，24（1）：74-76.

[11] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1999.

[12] 申煌煊，李 刚.分子生物学实验方法与技巧[M].广州：中山大学出版社，2010.134-135.

[13] 冯 兴.益生芽孢杆菌PAS38在肉鸡肠道中的消长规律及对肠道菌群调节作用研究[D].四川雅安：四川农业大学，2009.