苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1, Jagged1 mRNA表达的影响

【关键词】 苦参碱；肝；卵母细胞；大鼠；Thy

Effect of matrine on expressions of Notch1, Jagged1 mRNA in hepatic oval cell proliferation model rats

【Abstract】 AIM: To study the expressions of Notch1, Jagged1 mRNA in hepatic oval cell proliferation model rats and the effect of matrine on them. METHODS: Fortyeight male SD rats were randomly separated into 4 groups according to body mass: model group(group A),lowdose matrine group( group B, 5 mg/100g), highdose matrine group (group C, 25 mg/100 g), control group (group D). The expression of Thy1 protein was detected by enzymehistochemisty, and the expressions of Notch1, Jagged1 mRNA were detected by semiquantitative RTPCR method. RESULTS: Compared with group D ，the expressions of Thy1 protein, Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA in group A were singnificantly increased （P<0.01）. Compared with group A,the expressions of Thy1 protein, Notch1 mRNA,Jagged1 mRNA in group C were singnificantly increased（P<0.01）. CONCLUSION: Matrine could regulate Notch signaling, decrease the expression of Thy1 protein,which might be one of the mechanisms of inhibiting the proliferation of hepatic oval cells and inducing rat hepatic oval cells to differentiate into mature hepatocytes.

【Keywords】 matrine; liver; oocytes; rats; Thy1; Notch1

【摘要】 目的： 研究肝卵圆细胞增殖模型大鼠notch1, jagged1 mrna表达的变化及苦参碱对其的影响. 方法： 雄性SD大鼠48只按体重随机分为4组： 模型组（A组）；苦参碱小剂量（B组）；苦参碱组大剂量(C组)；D组即正常对照组. 用免疫组化方法观察造血干细胞标记(Thy1)表达的变化、半定量RTPCR方法观察肝组织中Notch1, Jagged1 mRNA表达的变化. 结果： 与D组比较，A组Thy1蛋白, Notch1mRNA, Jagged1 mRNA表达显著升高（P<0.01）,与A组比较,C组Thy1蛋白, Notch1mRNA, Jagged1 mRNA表达显著下调（P<0.01）. 结论： 苦参碱可有效的调节Notch信号通路、下调Thy1蛋白表达，可能是其抑制卵圆细胞过度增殖、诱导卵圆细胞向肝细胞方向定向分化的机制之一.

【关键词】 苦参碱；肝；卵母细胞；大鼠；Thy1；Notch1

0引言

卵圆细胞作为肝脏的干细胞在肝细胞损伤修复及癌变过程中起重要作用，但目前关于卵圆细胞的来源、特性、分化增殖的调控机制尚不十分清楚. 研究证实多种细胞因子参与了卵圆细胞分化发育的调节过程［1-2］. 本实验建立了大鼠肝卵圆细胞增殖模型，观察了卵圆细胞在肝组织内的分布及Notch1, Jagged1 mRNA在该模型中的表达情况，并探讨了苦参碱对其的作用.

1材料和方法

1.1材料苦参碱标准品购自中国药品生物制品检定所，二乙酰氨基芴（2AAF）购自Sigma公司，兔抗大鼠Thy1 IgG购自Santa Cruz公司，Notch1, Jagged1引物由上海生物工程公司合成，Trizol总RNA提取试剂盒, dNTPs, Oligo(dT)15Primer, MMLV逆转录酶、Tag DNA聚合酶均为美国Promega公司产品. 雄性SD大鼠48只，体质量130±20 g,由河北医科大学实验动物中心提供.

1.2方法雄性SD大鼠48只随机分为模型组（A组），苦参碱小剂量组（B组，按每100 g大鼠5 mg苦参碱灌胃），苦参碱大剂量组(C组，按每100 g大鼠25 mg苦参碱灌胃),正常对照组（D组）. A, B, C组饲以含0.15 g/L二乙酰氨基芴（2AAF）饲料1, 1 wk末按经典术式行2/3肝大部分切除术（PH），此后继续饲以含0.15 g/L二乙酰氨基芴（2AAF）饲料4, 5 wk末实验结束；B, C组于造模同时开始灌胃给药至实验结束；D组常规饲养以等量生理盐水灌胃. 分别于第3, 5 wk末，肝脏取材，一部分固定于40 g/L甲醛中准备石蜡包埋切片行HE染色，另一部分快速置于液氮中准备行冰冻切片免疫组化染色及RTPCR检测.

Notch1免疫组化染色采用PV二步法,按试剂盒说明操作. 染色结果采取半定量分析： 每组随机选6只动物，高倍镜下每张切片随机选择5个视野,应用MPIAS500高清晰度彩色图文分析系统对染色阳性部位灰度值进行定量分析.

用RTPCR方法检测肝组织中Notch1, Jagged1 mRNA表达水平. 总RNA抽提： 应用Trizol(一步法)总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA，采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，A260/A280之间，计算出提取总RNA浓度. 反转录：按Promega公司CDNA合成试剂盒说明操作，取RNA15 μg, MMLV反转录酶1 μL，总反应体积25 μL, 37℃反转录50 min, 95℃ 5 min灭活反转录酶. 引物设计： Notch1 mRNA引物序列参照Yuji Nishikawa等［3］发表的文献： 上游： 5′ atc cat ggc tcc atc gtc ta3′， 下游 5′ttc tga ttg tcg tcc atc ag 3′，产物422 bp; Jagged1 mRNA引物序列参照Charlotte HJ等［4］发表的文献： 上游: 5′ atg cgg tcc cca cgg acg cg3′， 下游: 5′aca ctc agg acc cat cca gc 3′ ，产物687 bp. 大鼠βactin引物序列：上游 5gcc atg tac gta gcc atc ca3，下游 5gaa ccg ctc att gcc gat ag3，产物375 bp. PCR总反应体积为25 μL包括： 2×Tag PCR MasterMix 12.5 μL,上、下游引物混合共2 μL,反转录的CDNA 1 μL,补ddH20至25 μL . 扩增条件为： Notch1: 94 ℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸5 min, 35个循环. Jagged: 94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸5 min, 35个循环. 取RTPCR产物4 μL，加上样缓冲液1 μL，在15 g/L琼脂糖凝胶（含EB）上电泳，80 V, 45 min，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（GelPro Analyzer Version 3.0）分析结果，以细胞中表达稳定的βactin基因为内参,用目的基因条带的灰度值与βactin基因条带的灰度值的比值为相对含量进行数据分析.

统计学方法：所有数据用SPSS 13.0软件处理，组间均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSDt检验, P<0.05表示有统计学差异.

2结果

2.1肝组织学检查HE染色A组动物肝小叶结构消失,可见大量卵圆细胞以汇管区为中心向肝实质内生长破坏正常肝小叶结构,卵圆细胞大小为正常肝细胞的1/2,胞浆少,核嗜碱性强. 同时见肝细胞呈现局灶性空泡样变及单核细胞浸润（图1）. B, C组见少量变异肝细胞, 少量卵圆细胞沿胆管上皮外侧呈单细胞排列生长，肝小叶结构较完整.

图1模型组肝组织汇管区内卵圆细胞增生HE ×200（略）

2.2Thy1免疫组化染色A组在假小叶内、汇管区周围可见椭圆形、不规则形状棕黄色阳性病灶区，为胞浆着色. D照组未见阳性病灶，A组与D组比较有统计学差异(P<0.01), 与A组比较B, C组阳性信号减少(P<0.01). B, C组之间也存在统计学差异(P<0.01，图2，表1）.

图2肝细胞异常增生灶内Thy1呈棕黄色阳性表达PV ×200（略）

表1各组大鼠肝组织Thy1蛋白, Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA表达比较（略）

aP<0.05, bP<0.01 vs A组; cP<0.05, dP<0.01 vs D组; eP<0.05, fP<0.01 vs C组.2.3RTPCR检测肝组织Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA表达与D组比较，A组Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA表达明显增强(P<0.01). 与A组比较，B, C组Notch1 mRNA和Jagged1 mRNA表达受到抑制（P<0.05和P<0.01），B, C组之间Notch1 mRNA和Jagged1 mRNA表达也存在统计学差异（P<0.01，图3,4，表1）.

1: 标记物； 2： 模型组样本； 3： 苦参碱小剂量组样本； 4： 苦参碱大剂量组样本； 5： 正常对照组样本.

图3肝组织中Notch1 mRNA的RTPCR电泳（略）

1: 标记物； 2： 模型组样本； 3： 苦参碱小剂量组样本； 4： 苦参碱大剂量组样本； 5： 正常对照组样本.

图4肝组织中Jagged1 mRNA的RTPCR电泳（略）

3讨论

正常成年肝脏是相对静止的器官，肝细胞的再生和受损保持平衡，肝脏受损能诱发其再生和修复，这是由肝细胞的自我复制实现的. 参与肝脏修复的细胞来源可能有两种： 一是肝细胞正常代谢及轻度肝损伤时，肝细胞通过自身的有丝分裂来弥补死亡的肝细胞；二是在肝脏受到严重损伤时，卵圆细胞被激活并向肝细胞分化以修复肝脏［5］. 部分学者认为，肝卵圆细胞即为肝脏的干细胞［6］，但一般认为卵圆细胞为肝干细胞的子代细胞［7］. 卵圆细胞首先出现在肝小叶外的终末胆管旁，然后迁移到肝实质内进一步分化为肝细胞和胆管细胞，修复和重建受损肝脏. 目前肝干细胞研究还处于基础阶段，对卵圆细胞激活、分化的具体信号转导机制及如何诱导卵圆细胞向肝细胞方向分化等问题尚不十分清楚.

本实验构建了大鼠肝卵圆细胞增殖模型，用免疫组化方法和RTPCR检测了Thy1蛋白和Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA在模型组及苦参碱干预组中的表达. 结果显示与与正常对照组比较Thy1蛋白,Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA在模型组中表达明显上调（P<0.01），经苦参碱干预后Thy1蛋白,Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA表达较模型组下调（P<0.05, P<0.01）. Thy1分子是一种高度保守的糖蛋白，在正常成人肝脏中并不表达，但在大多数胸腺细胞、胎肝、骨髓细胞的某些亚群及活化的卵圆细胞中可以表达. Petersen等［8］报道经Thy1等抗体标记，用流式细胞仪可以在2AAF/CCl4大鼠模型的肝脏中筛选95%~97%纯度的卵圆细胞群. 这说明卵圆细胞或者至少其某些亚群来源于骨髓，具有骨髓造血干细胞的特性. 本实验结果证实了这一点，在卵圆细胞增殖模型中可见到大量表达Thy1阳性的卵圆细胞，而正常对照组未见Thy1阳性表达，经苦参碱干预后Thy1表达下调，说明苦参碱可以诱导卵圆细胞向正常肝细胞方向分化. Notch信号途径是一种进化保守的细胞间信号转导机制，在决定细胞分化及维持一定量干细胞的过程中具有重要作用，调节几乎所有组织和器官的发育. 有报道表明Notch信号阻止了神经祖细胞向神经元方向分化［9］，在血液系统中造血干细胞高表达Notch分子. 而Notch信号对肝脏干细胞的作用如何目前尚未见报道，本实验进行了初步探讨，结果显示正常对照组中Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA低表达，模型组则高表达，经苦参碱干预后表达下调，表明Notch信号的激活维持了一定量的卵圆细胞，阻止了卵圆细胞向正常肝细胞方向分化，苦参碱通过下调Notch1 mRNA, Jagged1 mRNA的表达诱导卵圆细胞向肝细胞方向分化.

本研究结果提示Notch1, Jagged1 mRNA的高表达与卵圆细胞的增殖分化关系密切，苦参碱通过调节Notch1, Jagged1 mRNA表达干预的卵圆细胞的定向分化过程，但更详细的作用机制尚需进一步深入研究.

【参考文献】

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［9］ Henrique D, Hirsinger E, Adam J, et al. Maintenance of neuroepithelial progenitor cells by DeltaNotch signaling in the embryonic chick retina［J］.Curr Biol, 1997,7(9):661-670.