TTV核酸模板快速制备方法

作者：苏明权 ，冯继红 ，于文彬，徐光华 ，马越云，张建芳 ，张林，刘家云 【关键词】 TT病毒

关键词: TT病毒;聚合酶链反应;核酸制备

摘 要:目的 寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒（ttv）核酸快速制备方法，直接用于PCR扩增. 方法 应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法，分别制备TTV核酸做PCR模板，用于TTV的聚合酶链反应的快速检测. 结果 在30例非甲～非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患者血清，应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法，分别制备TTV核酸模板，在相同条件下进行PCR扩增，结果两种制备方法的符合率为89%. 结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒，目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法，对TTV肝炎的快速诊断，具有重要的意义.

Rapid preparation of transfusion transmitted virus nucleic acid template

SU Ming-Quan

1 ，FENG Ji-Hong

2 ，YU Wen-Bin

1 ，XU Guang-Hua

2 ，MA Yue-Yun

1 ，ZHANG Jian-Fang

1 ，ZHANG Lin

1 ，LIU Jia-Yun

1

1 Center of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospi-tal，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，2 Deparment of Infectious Diseases，College of Medicine，Yan'an University，Yan'an716000

Keywords:transfusion transmitted virus;polymerase chain reaction;DNA preparation

Abstract:AIM To establish a method adapting to rapid preparation of TTV DNA from bulk samples for PCR.METHODS TTV nucleic acid template was prepared for PCR using two methods，viz.hydroxybenzene chloro-form extraction and directly rapid cracking.RESULTS DNA abstracted by the two methods was amplified at same PCR parameter and the coincidence rate was89%.CONCLUSION TTV is a new discovered hepatitis virus and the main laboratory diagnosis method is to detect it's DNA by PCR，so it is very important to establish a method for rapid preparation of TTV DNA from bulk samples.

0 引言

TT病毒是近年新发现的一种肝炎病毒，当发现一种新的病原性相关病毒因子时，建立一种敏感、快速、特异的实验室检测方法并评价该病毒因子在肝病中的价值是十分重要的，该方法的临床适用性和可行性，是评价所建立方法在临床上应用价值的关键所在.目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法，对TTV肝炎的快速诊断，具有重要的意义.我们从临床快速检测需要为目的，寻求建立一种快速、简便的TTV核酸制备方法，用于大批量临床标本的检测，获得满意的结果.

1 材料和方法

1.1 材料

非甲～非庚型肝炎血清30例，来自延安大学医学院传染科;慢性乙型肝炎患者血清50例，来自西京医院就诊患者;引物及合成:根据Nishizawa等［1］ 报道的引物，外引物:RD037（正义链）5'-GCAGCAGCATATGGATATGT-3'RD038（反义链）5'-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3'，扩增片段:270bp;内引物:RD051（正义链）5'-ATACA-CATGAATGCCAGGC-3'RD052（反义链）5'-GTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3'扩增片段:196bp，由上海博亚生物技术有限公司合成.

1.2 方法

①蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法:50μL血清加200μL裂解液（50mmol・L-1 Tris-HCl pH8.0，200mmol・L -1 NaCl，10mmol・L-1 EDTA，20g・L-1 SDS，1g・L-1 蛋白酶K），60℃水浴60min，加等体积酚:氯仿:异戊醇（25∶24∶1）混匀，4℃冰浴下30min，2000g离心10min，取上清加等体积预冷无水乙醇-20℃过夜，1000g离心20min，沉淀溶于20μL0.1×TE缓冲液中，备用.②直接快速制备法:20μL血清加50μL快速裂解液（50mmol・L-1 Tris HCl，pH8.0，50mmol・L1 KCl，1.5mmol・L-1 MgCl，10g・L -1 NP-40，5g・L-1 Tween-205g・L-1 Triton X-100，2.0g・L-1 SDS）煮沸20min，1000g离心10min，取上清做模板.③PCR扩增:第1轮PCR扩增:总反应体积为25μL，包括:10×PCR缓冲液2.5μL;4×dNTP2.0μL;外引物各1.0μL（50pmol・L -1 ）;DNA模板5.0μL;Taq DNA酶3U・μL-1 ;无菌蒸馏水12.5μL;无菌石蜡油30μL覆盖液面，94℃变性3min，进入PCR循环，循环条件:94℃50s，55℃50s，72℃70s，32个循环，最后72℃延伸5min.第2轮PCR扩增:总反应体积为25μL，包括:10×PCR缓冲液2.5μL;4×dNTP2.0μL;内引物各1.0μL（50pmol・L-1 ）;第1次PCR产物5.0μL;Taq DNA酶1.5U・μL -1 ;无菌蒸馏水12.5μL;无菌石蜡油30μL覆盖液面，94℃变性3min，进入PCR循环，循环条件:94℃50s，55℃50s，72℃70s，32个循环，最后72℃延伸5min.④产物检测:取15μL第2次PCR扩增产物，于20g・L-1 琼脂糖（含EB）凝胶中，电泳100V30min，紫外灯下观察结果，出现196bp片段者为TTV阳性.

2 结果

2.1 30份非甲～非庚型肝炎2种TTV核酸制备方法检测结果

采用巢式聚合酶链反应（nest-PCR），对2种方法分别制备的TTV核酸为模板进行扩增，结果在30份血清中2种制备方法均同时检测出6份为TTV阳性，二者符合率为100%.

2.2 50份慢性乙型肝炎2种TTV核酸制备方法检测结果

采用巢式聚合酶链反应（nest-PCR），对2种方法分别制备的TTV核酸为模板进行扩增，结果在50份血清中，蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法检测出4份为TTV阳性，快速裂解法检出5份为TTV阳性，二者符合率为80%.

2.3 30份非甲～非庚型肝炎和50份慢性乙型肝炎的扩增结果

对30份非甲～非庚型肝炎患者血清分别制备TTV核酸制备方法均同时检测出6份为TTV阳性，阳性检出率为:20%.对50份慢性乙型肝炎2种TTV核酸制备方法检测结果:蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法检测出4份为TTV阳性，阳性检出率为8%，快速裂解法检出5份为TTV阳性，阳性检出率为10%.

3 讨论

1997年Nishizawa等［1］ 从不明原因的肝炎患者血清中及肝组织中检出一种新的肝炎病毒，命名为TT病毒（transfusion transmitted virus，TTV），是一单链、无包膜的DNA病毒，并认为该病毒与转氨酶升高密切相关，可能是病因不明肝炎的致病因子.当一种新的病原体发现时，在研究其致病性的同时，实验室检测方法的研究是十分重要的，在实验室诊断方法的建立上，方法学的临床可行性和适用性是临床应用的关键，由于临床检测标本量大，标本来源复杂，所以，即考虑到方法的可靠性，又要考虑到临床适用性，才能更好地为临床提供准确的诊断依据.我们对30份非甲～非庚型肝炎和50份慢性乙型肝炎，采用2种TTV核酸制备方法进行检测，其结果二者符合率分别为100%和80%，总符合率为:89%.Kanda等［2］ 对TTV感染进行流行病学调查研究，发现TTV在各种肝病中的感染率达43%～47%.而我国学者巍来等 ［3］ 对不同慢性肝炎患者血清中TTV检测，其阳性率，慢性乙型肝炎为:7%;慢性丙性肝炎为29%;慢性非甲～庚型肝炎为34%;傅恩清等［4］ 对西安地区病毒性肝炎患者TTV DNA的检测，其感染率高达60%.我们对30份非甲～非庚型肝炎患者血清分别制备TTV核酸制备方法均同时检测出6份为TTV阳性，阳性检出率为:20%.对50份慢性乙型肝炎2种TTV核酸制备方法检测结果:蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法检测出4份为TTV阳性，阳性检出率为8%，快速裂解法检出5份为TTV阳性，阳性检出率为:10%.在对1例蛋白酶K裂解酚氯仿抽提法阴性而快速裂解法阳性的扩增产物，进行测序结果证实为TTV引物所扩增的目的片段，1例蛋白酶K裂解酚氯仿抽提法扩增阴性结果可能是由于在抽提过程中造成丢失而导致，而快速裂解法不需抽提等步骤，直接用于扩增从而减少核酸的丢失.

目前，对TTV的研究仅对基因组有一定的了解，尚缺乏建立抗原、抗体检测方法的条件，所以对TTV核酸检测就成为目前唯一的证实病原体存在的方法，建立一个敏感、快速、简便、特异的基因检测方法，首要的问题就是解决临床标本中病原体核酸的有效制备，获得充分的目的靶基因，以确保方法学建立的可靠性和适用性.我们研制的TTV核酸模板快速制备方法，即充分考虑到方法的可靠性和稳定性，又具有快速、简便等特点，可为临床大批量标本的筛选检查提供了条件.

参考文献:

［1］Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，Yoshizawa H，Miyakawa Y，Mayumi M.A novel DNA virus（TTV）associated with ele-vated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of un-known etiology ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997;241（1）:92-97.

［2］Kanda T，Yokosuka O，Ikeuchi T.The role TT virus infection in viral hepatitis ［J］.Hepatology，1999;29（6）:1905-1908.

［3］Wei L，Tao QM，Pan XC，Zhang YC，Chang JH，Wu WY，Li KJ.Detection of TT virus DNA ［J］.Clin J Med Lab Sci，1998;21（5）:275-277.

［4］Fu EQ，Bai XF，Pan L，Li GY，Yang WS，Wang PZ.Detection of transfusion transm itted virus DNA in patients with viral hep-atitis in Xi'an by nested-PCR ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（7）:824-826.