AKA APF及抗CCP联合检测与类风湿关节炎的早期诊断

【摘要】

目的：联合检测类风湿关节炎（RA）患者血清中的抗环瓜氨酸抗体（CCP）和抗角蛋白抗体（AKA）、抗核周因子抗体（APF），探讨RA的早期诊断方法。方法：对已确诊的71例RA患者、207例非RA的自身免疫病患者同时测定抗CCP抗体（ELISA法）和AKA、APF（间接免疫荧光法）。结果：AKA、APF及抗CCP抗体对早期RA的敏感性分别为46.5%、77.5%和69.0%;特异性分别为100%、100%和98.8%。CCP及APF的阳性检出率高于AKA(p<0.01)而与类风湿因子(RF) 无差异(p=0.067).RF弱阳性或阴性的RA患者，AKA、APF及CCP可为阳性。结论：CCP抗体及APF对RA 具有较好的敏感性和高度的特异性,联合检测AKA、APF、CCP抗体可作为早期RA病人及RF阴性RA病人的早期诊断指标。

【关键词】 类风湿关节炎 抗环瓜氨酸肽抗体（CCP抗体） 抗角蛋白抗体（AKA） 抗核周因子抗体（APF）

The Relation of Examing the Anti-cyclic Citrullinated Peptide Antibody　Anti-keratin Antibody and Antiperinuclear Factor with the Early Diagnosing in Patients with Rheumatoid Arthritis

Abstract： Objective： To exam the anti-cyclic citrullinated peptide antibody(CCP),anti-keratin antibody(AKA) and antiperinuclear factor(APF) and to evaluate the diagnosis method of the rheumatoid arthritis (RA) .Method： Serum level of CCP,AKA and APF were examed simultaneously by ELISA and indirect immunofluorescence(IIF) respectively in 71 RA and 207 non-RA patients. Result： In RA patients, the sensitivity of anti-CCP, AKA and APF were 46.5%,77.5% and 69.0%,while the specificity were 100%,100% and98.8% respectively. As for sensitivity, there was a significant difference between the methods of anti-CCP,APF And AKA assay . However ,no difference was found between anti-CCP,APF And RF assay . The AKA,APF and anti-CCP can be positive in the RF positive RA patients and the negative RA patients. Conclusion： Anti-CCP and APF is quite sensitive and specific in the diagnosis of RA.To exam the anti-CCP, AKA and APF may be useful factors for early positive or negative RA patients.

Key words： Rheumatoid arthritis (RA)； Anti-cyclic citrullinuria peptide antibody(CCP)； Anti-keratin antibody(AKA)； Antiperinuclear factor(APF)

类风湿关节炎（RA）是一种常见的以对称性多关节炎为主要表现的慢性弥漫性自身免疫疾病，其病因和发病机制迄今尚未阐明［1，2］，而早期诊断和系统性治疗是防止关节畸性和致残的关键。以往RA的辅助检查只有X线和类风湿因子(RF)检测,X线改变多发生在关节受损以后，因而说不上早期诊断；而RF并非RA的特异性抗体，往往在其他自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化症（PSS），甚至正常老年人中都可以有一定程度的增高（正常老年人阳性率10%～30%［3］），因此往往RF只可作为RA常用分类标准的一个指标［4］。近年来研究发现，抗核周因子抗体（APF）、抗角蛋白抗体（AKA）、抗聚角蛋白微粒蛋白抗体（APA）等对RA的诊断具有特异性，且可用于RA的早期诊断［5～7］。2000年Schellekons首次人工合成出他们的共同抗原决定簇环瓜氨酸肽（Cyclic citrullinated peptide，CCP）,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了RA患者的CCP抗体，发现该抗体在RA诊断中具有较好的敏感性和高度的特异性［8,9］。近年来我们亦对我院门诊和住院的部分自身免疫疾病患者进行了AKA、APF、及CCP的检测。并与RF检测结果进行对照分析,现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 检测对象

1.1.1 RA组：确诊RA患者71例,均选自本院风湿科门诊及住院病人,其中男性21例，女性50例,年龄22～71岁,平均年龄(41.51±12.82)岁,病程1月至15年,平均病程(6.15±5.92)年,所有病例均符合1987年美国风湿病协会修订的RA分类诊断标准。

1.1.2 非RA组：非RA性自身免疫性疾病207例，其中男性64例、女性143例，年龄18～77岁，平均年龄（42.36～13.29）岁，其中系统性红斑狼疮（SLE）135例，骨关节炎（OA）47例，原发性干燥综合症（SS）11例，系统性硬化症（PSS）14例，以上疾病均符合相应的国际诊断标准。

1.1.3 正常对照组：均采自我院体检中心的机关体检者50例，均排除了各种自身免疫性疾病。

1.2 实验方法

1.2.1 抗CCP抗体的检测：ELISA法检测IgG型CCP抗体，试剂采用瑞典的欧洲诊断公司提供的试剂盒，操作过程严格按照说明书。以>25μ/ml为阳性。

1.2.2 AKA检测：采用德国欧蒙公司生产的免疫荧光试剂盒。以Wistar大鼠食管切片，血清1：10稀释，荧光显微镜下观察角质层呈线性，板层状荧光为阳性。

1.2.3 APF检测：抗原片自制：供者在早晨漱口后，用无菌海绵小块擦拭两边颊部后，放入10ml PH7.4PBS缓冲液中，挤出海绵吸附的细胞，悬液800G离心5min，弃去上清液，再洗一次，继续用10ml PBS-T缓冲液［0.5%（V/V）Triton X-100 PBS］ 混悬，静置10 min，800G离心5min，用PBS调整细胞数至100个/μl。点片，冷风吹干后，密封，-70℃低温保存［10］。APF检测操作：被检血清样品用PBS缓冲液1：20稀释后，滴加到抗原片上，放置1h，用PBS缓冲液洗三次，每次5 min，滴加稀释好的荧光素标记抗人IgG（德国欧蒙公司生产，稀释度为1：5），室温放置30min,PBS洗三次，每次5min。用含溴化乙啶缓冲甘油封片。在荧光显微镜10×40视野下观察5～10个视野，颊粘膜上皮细胞的核被EB染成桔红色，在核的周围，即细胞质中出现大小不等圆形或椭圆形均质荧光颗粒为阳性，全片中阳性细胞大于5个判为APF阳性，3～5个判为可疑，小于3个为阴性。

表1 4种自身抗体在四组中的阳性率和特异性（略）

注：RF的特异性与AKA、APF及抗-CCP比较有显著差异（P<0.01）

1.2.4 RF检测：免疫比浊法测定,仪器为美国BECKMAN公司的IMMAGE自动分析仪,以RF>20IU/ml为阳性。

1.2.5 统计学处理：不同指标间以及不同组间阳性率和特异性差异比较采用X2检验。

2 结果

71例RA患者，160例非RA类其他自身免疫性疾病患者，47例骨关节炎患者及50例正常对照组AKA，APF，抗CCP抗体及RF的检测结果见上表1。

3 讨论

RA是一种高致残性自身免疫性疾病。全世界发病率约1%［11］,我国的发病率达到0.34%~0.36%。鉴于RA的高致畸性,如何早期特异的诊断出RA一直是临床研究的热点。RF为诊断RA最早使用的血清学指标，其成份主要为19S的IgM。RF因其检测简便、快速、灵敏度高而得到广泛的应用。然而RF的特异性相对较低，很多自身免疫性疾病患者的血清中均可有RF的增高，甚至某些正常老年人中也有一些阳性率［3］，所有这些缺点较大的限制了RF在RA中的应用价值。

AKA是1979年Young等发现并命名的，其成分主要是IgG，AKA对RA具有较高的特异性，既往研究表明，AKA对RA的平均阳性率大于46%，特异性接近98%，被认为是RA最特异的生物学指标［12］，有作者发现AKA阳性的“健康人”，几乎均可发展成典型的RA［13］，这表明AKA在RA早期诊断中的重要作用。APF靶抗原存在于人颊粘膜角质透明颗粒中，1995年Sebbag从人颊站膜细胞中提取了该抗原，APF与AKA一样，都可以出现于早期RA患者中，1997年Kurki等提出APF与AKA是RA进行性发展的标志［13］。我们的检测结果中，AKA阳性的APF都阳性，这与相关文献报道的AKA和APF所针对的抗原是同一种抗原即角蛋白组丝状素原相符合［14］，然而AKA的检测灵敏度不如APF，又因为APF抗原片的保存时间较短（仅为1～2周），检测稳定性不及AKA，这方面尚待进一步研究探讨。抗-CCP抗体主要为IgG类抗体，CCP可以人工合成，因此有较高的灵敏度和特异性；又因为抗-CCP抗体测定可用ELIASA法检测，避免了APF与AKA测定应用间接免疫荧光检测法带来的操作烦琐、成本高并且稳定性不易控制等缺点，因而具有广阔的发展前景。本实验中抗CCP抗体阳性率和特异性分别为69.0%和98.8%，表明抗-CCP抗体检测是RA的一项特异性很高的血清学指标。另外国外有学者研究认为，抗-CCP抗体阳性的RA患者骨关节破坏程度较阴性者严重［15］，表明抗-CCP抗体检测对预测RA患者疾病的严重性具有较高的应用价值。

以上四种诊断指标各有其优点，可互为补充，四种指标联合检测的阳性率明显高于任何两种指标联合检测的阳性率，所以联合检测可以更早期、更准确的诊断RA。

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