不锈钢膜乳化法制备PLGA微球的初步研究与评价

[摘要] 目的：以水飞蓟宾药物为主药，利用不锈钢膜制备粒径均一的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球。方法：采用不锈钢膜乳化法，结合单因素考察优化微球的制备工艺，并对微球的平均粒径、粒径分布、载药量、包封率及体外释放等理化性质进行考察。结果：所得微球圆整度好，表面光滑，平均粒径（4.961±0.56） μm， 径距（1.75±0.18），包封率（54.997±4.05）%，载药量（23.16±1.70）%。结论：不锈钢膜乳化法可用于制备中药难溶性成分水飞蓟宾PLGA微球，且所制备的微球粒径均一可控，有较大的开发价值。

[关键词] 不锈钢膜乳化法；水飞蓟宾；PLGA微球

水飞蓟宾（silybin）是从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取所得的一种二氢黄酮木质素类化合物。水飞蓟宾是含2个非对映体水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的混合物，2种非对映体物质的量比约为1∶1。水飞蓟宾对急性慢性肝炎、代谢中毒性肝损伤和肝硬化具有较好的疗效[1]，近年研究发现，水飞蓟宾在作为化疗保护和抗癌以及神经保护等方面具有较大研究价值[2]。但是，水飞蓟宾由于难溶于水，口服吸收生物利用度低，因此有必要开发其新剂型有利于提高其生物利用度而增加其疗效[3]。本实验将不锈钢膜乳化法应用于水飞蓟宾微球的制备当中，以期得到粒径较小且均一的水飞蓟宾微球，提高水飞蓟宾的生物利用度，同时延缓水飞蓟宾的释药速度，达到缓释的目的，减少给药次数，提高用药安全性。本实验将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）作为载体材料，对平均粒径、粒径分布、载药量、包封率等重要指标进行检测，从而初步评价不锈钢膜乳化法在中药难溶药物微球的应用[4]。

1材料

JEM-6700F 冷场发射扫描电子显微镜（日本 JEOL公司），高速离心机（上海安亭科学仪器厂），LGJ-12冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司），马尔文激光粒径测试仪（Mastersizer 2000，英国马尔文仪器有限公司），岛津液相LC-20A（岛津企业管理中国有限公司），快速膜乳化器（中国科学院过程工程研究所），不锈钢膜乳化装置（北京中医药大学）。

水飞蓟宾（西安华萃生物技术有限责任公司），PLGA（LA-GA 75∶25，平均相对分子质量15 kDa，山东医疗器械研究所），聚乙烯醇（PVA）1788（山西三维集团股份有限公司），乙酸乙酯、甲醇、乙腈等（Fisher，色谱纯）。

2方法与结果

2.1微球的制备

将水飞蓟宾溶于乙酸乙酯中，加入PLGA超声至溶解，制成油相。PVA溶于水中，搅拌至溶解制成水相。将油相加入水相搅拌1 min，倒入快速膜乳化器中，氮气加压，通过不锈钢膜，制成O/W乳液。乳液中加入生理盐水磁力搅拌固化1 h，离心清洗3次，每次5 min，最后将微球分散于生理盐水中，抽真空冷冻干燥，得成品。

2.2含量测定方法的建立

2.2.1标准曲线的建立 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相甲醇-1%冰醋酸（48∶52）；柱温30 ℃；流速0.8 mL·min-1，进样量10 μL。精确称量水飞蓟宾0.010 8 g，溶于100 mL量瓶中，用甲醇-乙腈（2∶1）溶液超声溶解，稀释定容至刻度，配制成质量浓度为108 mg·L-1的水飞蓟宾溶液。精密移取8，6，4，2，0.1 mL水飞蓟宾溶液置于10 mL量瓶中，定容至刻度，分别配置成质量浓度为86.4，64.8，43.2，21.6，1.08 mg·L-1的水飞蓟宾溶液。以水飞蓟宾质量浓度（mg·L- 1）为横坐标，水飞蓟宾峰面积（水飞蓟宾A与水飞蓟宾B峰面积之和）为纵坐标进行回归。得到水飞蓟宾线性回归方程Y=30 848X-16 873，r=0.999 2，在1～100 mg·L-1峰面积与质量浓度呈良好线性关系。

2.2.2精密度、稳定性及重复性考察 取上述64.8 mg·L-1的水飞蓟宾溶液，连续进样5次，每次10 μL，测定计算得RSD 0.37%，表明该方法精密度良好。

在0，4，8，12，24 h 分别进样64.8 mg·L-1的水飞蓟宾溶液10 μL，测定峰面积，结果RSD 1.2%，说明样品溶液在24 h内稳定。

取同一批号水飞蓟宾5份配置成质量浓度为64.8 mg·L-1的水飞蓟宾溶液进样，测定峰面积，结果RSD 0.59%，说明重复性良好。

2.2.3加样回收率试验 精密称取空白微球5 mg，置于10 mL量瓶中，分别加入高、中、低质量浓度（86.4，43.2，1.08 mg·L-1）的水飞蓟宾溶液1 mL，用甲醇-乙腈（2∶1）溶液定容至刻度。进样，测定峰面积，重复3次，计算回收率，高、中、低浓度的平均加样回收率分别为99.87%，100.1%，102.4%，RSD分别为1.0%，1.2%，1.2%。

2.3包封率与载药量

精密称取微球5 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇-乙腈（2∶1）超声至微球溶解，稀释定容至刻度，用HPLC进行测定。载药量=微球中药物质量/微球质量×100%，包封率=微球中药物质量/投入的总药量×100%。

2.3.1单因素考察 分析影响因素及考察结果，见表1，综合平均粒径与径距，确定药物与PLGA用量比为1∶4，油相水相比1∶4，PVA浓度为3%，过膜压力因素中1.4 MPa较好，但考虑到操作安全性，简易性，用压力1.0 MPa较为合适。结合单因素考察结果，筛选2个对微球性质影响较大的因素通过正交设计对工艺进行优化，即药物辅料用量比（A）、油相水相比（B），再结合不同孔径不锈钢膜（C），以平均粒径与径距作为评价指标。通过 L9 （ 34） 正交设计试验优选出最佳工艺条件。

因时间原因本实验只做到25 d，剩余载药微球用甲醇-乙腈（2∶1）进行超声溶解后用HPLC测定，剩余微球含药量为538.08 μg，结合之前释放总量，载药微球释放率预计可达到70%以上。

3结果与讨论

3.1不锈钢膜乳化法制备微球的影响因素

不锈钢膜乳化法制备微球工艺大致与快速膜乳化法相同，包括预乳液制备、固化、离心、冻干等步骤。本实验通过对油相中药物与PLGA用量比、油相水相比、水相浓度（PVA浓度）、过膜压力（MPa）等因素考察，最终确定了最优工艺条件为：膜孔径1 μm，油相水相比3∶7，药辅比1∶4，水相浓度3%，过膜压力1.0 MPa。其中膜孔径因素对径距有显著影响，理论上膜孔径越小，效果越佳，但考虑到此装置膜材为三膜串联，孔径过小的组合可能会引起管路堵塞，从而影响微球参数。

3.2载药微球的释药行为

目前，相关水飞蓟宾微球的研究较少且载药量普遍较低，通过不锈钢膜乳化法制备的微球体外释放较为均匀，载药量达到20%以上，释药量与回收量总和达到总药量的70%以上，结合回收量、释放曲线与释放后期可能产生的微球崩解而引起的快速释放，笔者认为释放周期可至少维持在40 d以上。水飞蓟宾微球具有缓释的性质，通过扫描电镜的观察，微球表面光滑，无塌陷，无孔道，推测微球的释药行为为溶蚀性溶出。从释放曲线可以看出，在释放前期出现突释现象，对于首次给药需要负荷量的药物，满足了首次给药的需求，促使血药浓度达稳[6]。突释过后，进入稳定释放期，药物释放主要是由于微球骨架溶蚀引起的，聚合物链不断裂解，同时在溶解阶段聚合物碎片进一步裂解为分子，所以药物在聚合物骨架溶蚀和降解双重作用下释放[7]。

3.3不锈钢膜乳化法

本研究在快速膜乳化技术的前提下，将应用较多的SPG膜材改为不锈钢膜材，并发明了一套连续膜装置制备微球[8]。本实验以水飞蓟宾为药物，PLGA为辅料制得的微球圆整度较好且表面光滑。相比于SPG膜所制的微球，不锈钢膜乳化法所得微球平均粒径大于前者，包封率略小于前者，但在径距与载药量这2项参数上均有大幅改善。不锈钢膜乳化法还有如下优点：膜通量较大，可通过增加物料提升产量；膜材应用钢粉烧结技术[9]，非常耐用；膜材成本大幅下降；机械程度高，膜材可自由组合便于同其他技术手段联用。

不锈钢膜乳化法可制备粒径均一可控的微球，在这一领域有较大发展前景，作者以期通过更多实验从多方面评价探索不锈钢膜乳化法。

[参考文献]

[1] 付艳霞. 水飞蓟宾胶囊配合辨证中药对17例肝病患者ALT、AST、TG、TC的影响[J]. 世界中医药，2009，4（4）：207.

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[3] 陆瑾，张连军，乐康，等. 提高水飞蓟宾口服生物利用度的研究进展[J]. 华西药学杂志， 2010， 25（5）： 612.

[4] 孙美丽，班俊峰，黄思玉，等. PLGA微球载药量和包封率的影响因素及控制[J]. 广东药学院学报， 2011（6）： 643.

[5] 何杨，刘彬丽，李木子，等. 快速膜乳化-溶剂萃取/挥发法制备水飞蓟宾PLGA微球的工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志， 2013， 19（1）： 1.

[6] 王彦君，毛世瑞，孙伟，等. 白藜芦醇PLGA长效注射微球的制备及工艺考察[J]. 沈阳药科大学学报， 2010， 27（4）： 265.

[7] J Siepmann，A Gpferich. Mathematical modeling of bioerodible， polymeric drug delivery systems[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2001， 48（2/3）： 229.

[8] 田瑞，王连艳，吴颉，等. 快速膜乳化法制备粒径均一的PLGA微球和微囊[J]. 过程工程学报， 2009， 9（4）： 754.

[9] 何朋，王均安，徐新平. 粉末冶金制备不锈钢的研究及发展[J]. 金属热处理， 2004， 29（7）： 1.

Study and evaluation of preparation of silybin PLGA microspheres by

stainless steel membrane emulsification technique

RONG Kun1， LIU Bin-li1， LI Mu-zi1， XU Liang-liang1， YI Xin1， CAI Cheng-ke2*

（1.School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2.Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract] Objective： The aim of the present study was to prepare uniform-sized silybin loaded poly （lactic-co-glycolic acid） （PLGA） microspheres in study of silybin with stainless steel membrane. Method： Silybin PLGA microspheres were prepared by stainless steel membrane emulsification. The preparation conditions were optimized by single-factor test and orthogonal experiment， and evaluating the mean diameters， the particle size distribution， drug loading， entrapment efficiency and morphology of microsphere. Result： Prepared microspheres were round and surface was smooth. The mean diameter was （4.961±0.56） μm. The span was （1.75±0.18）. The entrapment efficiency was （54.997±4.05）% and the average drug loading was （23.16±1.70）%. Conclusion： The stainless steel membrane emulsification can be used to prepare the silybin PLGA microspheres. The mean diameters of the silybin PLGA microspheres can be controlled in certain level. Stainless steel membrane emulsification has great potentiality exploitation and utilization.

[Key words] stainless steel membrane emulsification； silybin； PLGA microspheres

doi：10.4268/cjcmm20140716