他莫昔芬通过容积激活性氯电流抑制肝癌细胞增殖

[摘要] 目的:探讨他莫昔芬(TAM)对人肝癌SMMC 7721细胞增殖的影响以及与容积激活性氯电流的关系。方法:MTT法检测TAM对细胞增殖的作用;流式细胞术检测TAM对细胞周期的影响;全细胞膜片钳技术观察TAM对容积激活性氯电流的抑制作用。结果:TAM能浓度依赖性地抑制SMMC 7721细胞的增殖和低渗激活的容积激活性氯电流,两者呈正向直线相关;TAM也阻滞细胞周期于G0/G1期。结论:TAM通过调节容积激活性氯通道的开放抑制SMMC 7721细胞的增殖,容积激活性氯通道可能是TAM抗肿瘤特别是雌激素受体阴性肿瘤的靶点。

[关键词] 肝癌;他莫昔芬;细胞增殖;氯通道

[中图分类号] R963[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(a)-039-03

Effects of Tamoxifen on proliferation and volume-activated chloride current in human hepatocellular carcinoma cells

MAO Jianwen1, XU Bin2, WANG Weizhang1, YUAN Jian1, CHEN Weiqiang1, LI Hongzhi1

(1.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,China;2. School of Life Science and Biopharmacology, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

[Abstract] Objective: To investigate the role of the volume-activated chloride current (Icl,vol) on inhibition effects of tamoxifen on the proliferation in human hepatocellular carcinoma cells SMMC 7721. Methods: MTT assay was used to determine the inhibition of TAM on cell proliferation. The whole cell patch clamp technique was used to observe the effects of tamoxifen on Icl,vol. Results: Tamoxifen inhibited the cell proliferation, Icl,vol in a concentration-dependent manner and arrested cell cycle on G0/G1 phase. Analysis of the relationships between the current and cell proliferation showed that the current was positively correlated with cell proliferation. Conclusion: These data indicate that tamoxifen may inhibit cell proliferation by modulating Icl,vol. The Icl,vol may be an extra-estrogen receptor site of action for tamoxifen and may account, in part, for its anti-growth effects on estrogen receptor-negative cancers.

[Key words] Hepatocellular carcinoma; Tamoxifen; Cell proliferation; Chloride channels

他莫昔芬(tamoxifen,TAM) 又称三苯氧胺,是一种非甾体类抗雌激素药物。目前广泛应用于雌激素受体阳性的乳腺癌和卵巢癌的临床治疗[1]。但研究发现TAM也对雌激素受体阴性的某些肿瘤(如肝癌[2]、肺癌[3]和前列腺癌[4])有治疗作用,其机制尚未阐明。近年研究发现TAM也是容积激活性氯电流抑制剂[5-6],能有效阻抑容积激活性氯通道的开放,而后者在肿瘤细胞生长中扮演了重要的角色。本实验拟探讨容积激活性氯电流在TAM抑制肝癌细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人原发性肝癌细胞SMMC 7721用含10%小牛血清、1×105 U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的RPMI-1640培养液常规培养在37℃、5% CO2培养箱中,隔天传代。

1.2 细胞增殖检测

将细胞接种至96孔板中,使其每孔细胞数为1×104个,培养12 h后,加入不同浓度的TAM,于24、48、72 h后进行检测。每孔加入MTT(噻唑兰,5 mg/ml)溶液20 μl, 37℃继续培养4 h后弃上清,每孔加入100 μl DMSO溶解样品,用酶联免疫检测仪测定各孔570 nm吸光度值,计算均值,绘制生长曲线。

1.3 细胞周期的检测

将处理组和对照组SMMC 7721细胞胰酶消化后通过400目的筛网制成单细胞悬液,离心,PBS洗涤2次后75%预冷的乙醇固定,加入PI染液1 ml,轻柔吹打后混匀,避光染色20 min,流式细胞仪测定细胞周期。

1.4 电生理实验

全细胞膜片钳记录:将收集到的细胞悬液接种于培养皿中22 mm小玻片上,细胞置于培养箱中培养1 h后,取出玻片做全细胞膜片钳实验。膜片钳参数设置和记录方法见参考文献[5]。

电生理学实验所用液体:等渗灌流液渗透压为300 mOsmol/L,含:70 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L MgCl2,2 mmol/L CaCl2,10 mmol/L HEPES和140 mmol/L甘露醇。47%低渗灌流液渗透压为160 mOsmol/L,除不含甘露醇外,其他成分和浓度与等渗灌流液相同。各灌流液分别用Tris液调pH值至7.4,用冰点渗透压计检测渗透压。电极内液含:70 mmol/L N-methyl-D-glucamine chloride (NMDG-Cl),1.2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L EGTA、140 mmol/L甘露醇和2 mmol/L ATP, 用Tris调pH值至7.25。

1.5 统计学处理

数据用x±s表示,单因素方差分析检测均数差异显著性,分析软件使用SPSS 11.0软件。

2结果

2.1 TAM作用后对SMMC 7721细胞增殖的影响

实验浓度的TAM明显抑制SMMC 7721细胞的增殖,其作用呈明显时间-浓度依赖(图1 A),随着TAM 作用时间延长,TAM 对SMMC 7721细胞的抑制作用不断增强, 24、48、72 h 组之间相比,差异均有统计学意义(P

图1 TAM对SMMC 7721细胞增殖的作用

Fig.1 Inhibition of SMMC 7721 cell proliferation by tamoxifen

2.2 TAM对SMM C7721细胞周期的影响

15 mol/L TAM作用SMMC7721细胞24、48、72 h时,与对照组相比较,随着时间的延长G0/G1 期细胞明显增加,S 期细胞明显减少,G0/G1 期细胞由对照的(50.21±2.1)%,72 h时增加到(78.21±2.6)%(P

图2 TAM对SMMC 7721细胞周期的作用

Fig.2 Arrest of SMMC 7721 cell cycle progression by tamoxifen

2.3 TAM对SMMC 7721细胞容积激活性氯电流的影响

在47%低渗刺激条件下, SMMC 7721细胞产生容积敏感性氯电流,表现为弱外向优势,没有明显时间依赖性失活(图3 A) 。钳制于+80 mV 时, 电流密度为(58.21±7.43) pA/pF。细胞外灌流不同浓度的TAM,可抑制细胞容积激活性氯电流,随浓度升高,抑制作用逐渐增加。30 mol/L TAM几乎完全抑制容积激活性氯电流。IC50为(16.1±1.5) mol/L(图3 B)。

图3 TAM对SMMC 7721细胞容积激活性氯电流的作用

Fig.3 Inhibition of volume-activated chloride currents of SMMC 7721 cells by tamoxifen

2.4 TAM抑制SMMC 7721细胞增殖与容积激活性氯电流的关系

上述结果提示TAM能同时抑制SMMC 7721细胞增殖和容积激活性氯电流,为了探讨容积激活性氯电流在TAM抑制SMMC 7721细胞增殖中的作用,对相同浓度作用下的细胞增殖和容积激活性氯电流抑制率的相关性进行了分析,结果显示:两者呈正向直线相关(r=0.97,图4)。

图4 TAM抑制细胞增殖和容积激活性氯电流的相关性

Fig.4 the correlation between cell proliferation and the

volume-activated chloride current

3 讨论

他莫昔芬是一种雌激素拮抗剂。由于其副作用小及患者耐受性好而广泛应用于治疗乳腺癌、子宫内膜癌及子宫内膜异位症。近年的研究也发现TAM对某些雌激素受体阴性的肿瘤有治疗作用,其机制尚未明确。本实验结果显示TAM能浓度-时间依赖性的抑制雌激素受体阴性的肝癌SMMC 7721细胞的增殖,同时TAM也能浓度依赖性的抑制容积激活性氯电流。TAM对两者抑制作用具有几乎相同的IC50(抑制细胞增殖:(17.3±2.1) mol/L;抑制容积激活性氯电流:(16.1±1.5) mol/L,且TAM对两者的抑制作用呈正向直线相关。说明TAM可能通过抑制容积激活性氯通道的开放从而抑制了肿瘤细胞增殖。

TAM能同时抑制癌SMMC 7721细胞的增殖和容积激活性氯电流,那么TAM对容积激活性氯电流的抑制作用如何影响细胞增殖?接近IC50浓度的TAM(15 mol/L)作用于SMMC 7721细胞后,24、48、72 h分别收集细胞检测细胞周期,结果提示随着时间的延长, G0/G1 期细胞明显增加,S 期细胞明显减少。提示TAM阻滞了SMMC 7721细胞周期从G1期到S期的进展,从而抑制了细胞的增殖。

容积激活性电流在调节性细胞容积减少(RVD)中扮演了关键性的作用[7-8],水和离子流动以及细胞容积的改变,不论是肿胀或是皱缩都将影响细胞内各种大分子有机物的浓度,其中包括参与DNA合成的各种酶[9]。而在细胞周期进程中,细胞容积是逐渐增大的,尤其是在G1/S期转换点,而细胞可通过细胞容积调节的主要机制之一RVD 来维持细胞容积平衡[10]。在细胞G1/S期转换点,细胞需要摄取氨基酸、蛋白质合成原料以及处理细胞周期调节信号[11]。容积激活性阴离子通道在周期进程中作为细胞增殖所需的代谢复合物 (如氨基酸)的潜在转运体而发挥作用[12]。TAM很可能通过抑制容积激活性氯通道的开放从而影响了G1期向S期转换所需调节蛋白合成必须的物质的摄取,进而影响了细胞周期的进展,最终抑制了细胞的增殖。

综上所述,本研究展示了TAM能抑制肝癌SMMC 7721细胞的增殖,且其作用受容积激活性氯电流的调控。结果有助于进一步阐述TAM抗肿瘤作用的机制,特别是对雌激素受体阴性的肿瘤的作用。

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(收稿日期:2009-02-16)