钆喷酸葡胺脂质体的制备与研究

【摘要】 本文采用改良逆相蒸发法-膜挤压法相结合将水溶性顺磁性造影剂钆喷酸葡胺制成小单室脂质体（SUV），方法简单、重现性好，显示了可进一步工业化的良好前景。激光散射法测得脂质平均粒径为195nm。4℃避光放置6个月，各项理化指标基本无变化。对制剂的急性毒性研究结果表明，钆喷酸葡胺及钆喷酸葡胺脂质体的ivLD50值分别为8.00mmol/kg和9.56mmol/kg，这提示脂质体可降低药物的毒性。而影像学结果进一步证明了钆喷酸葡胺脂质体具有靶向性。 【关键词】 钆喷酸葡胺；脂质体；制备研究

Research and preparation of liposomal Gd-DTPA

【Abstract】 We used a modified reverse-phase rotary evaporate-extrution method to obtain liposomes containing Gd-DTPA. We had developed a modified one of this technique. The method was simple and good reproduce. It was ideally suitable for scaling-up for production purpose. The mean diameter of liposomes was 195nm, which was determined by laser scattering，this liposomal formulation had no evident effects under 4℃. The iv LD50 of free and liposomal Gd-DTPA was 8.00mmol/kg and 9.56 mmol/kg, respectively. This suggested that Gd-DTPA liposomes had a proven effect in reducing toxicity. Result of imaging confirmed liposomal Gd-DTPA possesed target for liver and spleen.

【Key words】 Gd-diethylenetriamine pentaacetic acid;liposomal;preparation and research

1982年由德国先灵（Schering AG）公司的威曼等人制备成功的钆喷酸葡胺［（NMG）2-Gd-DTPA］是研究和应用最多的造影剂，并在1984年报告了首次应用于人体的结果。由于它能在正常和病变组织间增加额外对比度，使MRI诊断的敏感性和特异性均得以提高，故很快被人们所接受。钆喷酸葡胺是细胞外离子型造影剂［1］，它主要用于颅脑、脊柱及全身的磁共振成像，特别是对脑的造影是安全有效的［2～6］。由于它主要通过肾脏快速代谢［1,7］，能与细胞外空间快速平衡及快速的肾清除，不适用于肝、脾肿瘤的成像［8～10］。在分布上无特殊的靶器官，或者说它是一种无专一性分布的造影剂。为了提高肝、脾肿瘤的成像效果，使钆喷酸葡胺具有器官靶向性，可用脂质体作为药物的载体来达到此目的。在这方面的研究国外已有报道［11～14］，实验证明了包封于脂质体中的钆喷酸葡胺具有肝、脾器官靶向性。本实验以豆磷脂和胆固醇为成膜材料，制备了钆喷酸葡胺脂质体，并对其体内外稳定性进行了研究，以期为钆喷酸葡胺脂质体的进一步开发以及将来应用于临床提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高速离心机（沈阳理化仪器厂），Zetasizer 3000（英国Malvern仪器公司），ZM-420透射电镜（Philips），NDJ79旋转式粘度计（同济大学机电厂），DL302-1电热恒温箱（上海天淞五金厂）。

1.2 材料 Gd2O3（北京有色金属研究院），DTPA（北京福星化工厂），甲葡胺（北京北陆医药有限公司），精制大豆磷脂（上海油脂一厂），胆固醇（上海生化试剂厂），钆喷酸葡胺注射液（先灵〈广州〉药业有限公司），生理盐水（双鹤药业），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 钆喷酸葡胺脂质体的制备 参考文献初步拟定以下基础处方［15］：300mg卵磷脂，75mg胆固醇及0.1%量的VE，制成10ml。

2.1.1 改良逆相蒸发法 精密称取300mg卵磷脂，75mg胆固醇及0.1%量的VE，用4ml氯仿和8ml异丙醚溶解。将Gd-DTPA溶于10ml缓冲液中，从中取4ml该缓冲液于油相中，涡流震荡3min，室温水浴中超声5min，把制得的W/O型乳液于50℃水浴中温浴1min，然后于30±0.5℃水浴中减压旋转蒸发至形成凝胶状的物质，再加入剩余的6ml含药的缓冲液，升高水浴温度至35±0.5℃，减压旋转蒸发，得到分散均匀的脂质体混悬液。

2.1.2 膜挤压法 将上述脂质体混悬液在一定的压力下，依次通过0.8、0.45、0.22μm微孔滤膜，每次重复6遍，最终得到均匀乳状的钆喷酸葡胺脂质体。

2.2 处方优化 根据单因素考察结果，首先确定缓冲液的离子强度，处方成分为磷脂、胆固醇、十八胺和药物，把磷脂（PC）用量、胆固醇（Chol）用量、十八胺（SA）用量及成膜时温度（T）作为4个考察因素。选择U10（104）均匀表可得10组处方，利用人工神经网络系统进行处方优化，主要考察指标为脂质体的外观、KE值及沉降体积比F，最终确定最佳处方为：磷脂250mg，胆固醇50mg，十八胺20mg，药物浓度0.5M，制备成脂质体10ml。

2.3 含量及包封率测定

2.3.1 总药量的测定 氯仿萃取磷脂：精密吸取1ml脂质体，用制剂缓冲液稀释至一定倍数， 取稀释液5ml具带塞试管中，加少许固体氯化钠，加入等量氯仿后置60℃水浴之中3min，强烈涡流振荡2min，于离心机4000r离心10min，取上清液在吸收波长274nm及320nm分别测定吸光度值A。根据标准方程：

ΔA=0.0204C+0.008计算总药量。

2.3.2 包封率测定 包封率（encapsulation efficiency,EN%）是脂质体的一个重要质量指标，一般可用体积包封率QV、药脂包封比EW或用重量包封率QW来表示，本文采用重量包封率来表示，即单位体积包入脂质体的药物量（总药量-游离药物量）与总药量的比值，可用式（2-1）表示：

QW=W包 W总=W总-W游 W总（2-1）

透析法：此法是最简单的也是最常用的除去未包裹药物的方法，它不需要复杂的技术，也无须昂贵的仪器，且能够扩大生产。本实验对此方法进行考察，结合紫外法测定了钆喷酸葡胺脂质体的包封率。测得包封率平均为25.6%。

2.4 粒度分布 将脂质体用水稀释后在激光粒度分析仪上进行测定。结果表明，脂质体平均粒径为195nm。

2.5 脂质体稳定性的研究

2.5.1 含量及包封率的测定 将钆喷酸葡胺脂质体充N2后密封于安瓿中，于4℃冰箱及25℃孵箱中避光贮存，分别在1、3、6月取样，测定制剂的含量，并计算贮存过程中的包封率，结果见Tab.1。Tab.1 Results of stability determination of GD-DTPA containing liposome under the condition of 4℃ or 25±1℃

2.5.2 外观变化考察 钆喷酸葡胺脂质体4℃放置6个月后，外观未见明显变化，安瓿底部未见沉聚物，显微镜下观察，粒径略有增大；25℃放置6个月后，外观未见明显变化，微镜下观察，粒径明显增大，并可见少量聚集。

综上所述，钆喷酸葡胺脂质体在4℃贮存6个月后，制剂的物理和化学稳定性良好，其外观、含量均变化不大，包封率下降也很低，仅为2%左右，粒径略有增大；而其在25℃贮存6个月后，制剂发生了一些物理变化，微粒有沉降聚集的现象发生，包封率下降为8%左右，且粒径明显增大。所以脂质体应在低温（4℃）下避光、密封贮存。

2.6 急性毒性实验

2.6.1 静脉注射给药LD50的测定 取雌雄小鼠50只，随机分成5组，雌雄各半，每组10只。各组按1：0.8的剂矩，注射钆喷酸葡胺水溶液组的剂量分别为5.1、6.4、8.0、10.0和12.5mmol/kg，每只鼠一次尾静脉注射0.15ml，注射速度为1ml/min。注射后观察动物中毒症状，记录一周内动物死亡数，计算出LD50及95%可信限。

同法进行钆喷酸葡胺脂质体静脉注射LD50的测定，剂量分别为6.4、8.0、10.0、12.5和15.6mmol/kg。

2.6.2 结果 小鼠尾静脉注射钆喷酸葡胺水溶液后，立即出现呼吸急促、腹部急剧起伏、弓背、下肢伸展等中毒症状，部分小鼠0～3min内即死亡，在以后的1周内，小鼠有食量减少，排泄物稀、多、粘，精神萎靡等中毒症状。小鼠尾静脉注射钆喷酸葡胺脂质体后，与上述中毒症状相似。以同样速度注射，死亡时间略有延迟，部分小鼠5 min后中毒死亡。结果见Tab.2和Tab.3。由改进寇氏法求得，钆喷酸葡胺水溶液对昆明小鼠的ivLD50为8.00mmol/kg （7.22～8.86mmol/kg）；而钆喷酸葡胺脂质体的ivLD50为9.56 mmol/kg（8.43～10.85mmol/kg）。

3 影像学研究

3.1 菌种 H22肝癌瘤株由北京肿瘤防治研究所提供，每周腹腔注射1次传代。

3.2 肝癌实体瘤模型制作 向每只小鼠左腋窝皮下接种0.2ml含1.4×107个瘤细胞的生理盐水混悬液，7天后待肿瘤长到直径为1～1.5cm时用于实验。

3.3 磁共振成像 将接种上肝癌的小鼠分成两组：第一组，尾静脉注射市售的钆喷酸葡胺注射液；第二组，尾静脉注射钆喷酸葡胺脂质体。将注射药物后的小鼠进行磁共振扫描成像，观察肿瘤部位与正常组织间的区别，同时对两组成像效果进行比较，图像Fig. 1和Fig. 2如下（略）。 由图像可以看出，注射钆喷酸葡胺脂质体（b）小鼠的肝肿瘤部位明显比其他正常组织发亮；而注射液组（a）肝肿瘤部位与正常组织的对比度不明显。因此，钆喷酸葡胺脂质体组与其注射液组相比更适合肝肿瘤的造影，它明显增强了肝肿瘤部位与正常组织间的对比度，影像学研究也表明了钆喷酸葡胺脂质体可作为肝靶向造影剂。

4 讨论

（1）本文曾采用煮沸及流通蒸气法对脂质体进行灭菌，但结果发现，有少量的磷脂聚集现象，并且包封率降低明显。对于脂质体这种含有不耐热和易氧化组分的微分散系统来说，高温灭菌对其破坏性较大，而且也有文献报道水溶性药物的脂质体不宜进行热灭菌［16］。所以本文在制备脂质体的过程中采用无菌操作与膜过滤灭菌方法相结合。

（2）本文进行脂质体包封率测定时，曾采用过柱分离法和鱼精蛋白凝聚法。柱分离时由于钆的紫外特征峰的吸光度小，所以上柱稀释后，在线检测无法确定脂质体和游离药物是否分离完全；而鱼精蛋白凝聚时，发现仍有少量脂质体在水溶液中，这给测定带来很大的误差。由于钆喷酸葡胺极易溶于水，并且分子量也较小，对于透析法测定包封率是非常有利的，游离药物和脂质体可以完全分离开，所以本文采用了透析法测定脂质体的包封率。

（3）影像学研究中，本文采用的模型是异位移植，主要看肿瘤与肝脏在给药后的对比度。肿瘤移植的位置在图片的左上角，注射液组（a）肝肿瘤部位（变亮）与肝组织（变亮）的对比度不明显，而注射钆喷酸葡胺脂质体（b）小鼠的肝肿瘤部位（变亮）与肝组织（基本无变化）的对比度明显，所以表明了钆喷酸葡胺脂质体可作为肝靶向造影剂。

【参考文献】

1 Brasch RC, Weinmann HJ, Wesbey GE. Contrast enhanced NMR imaging: animal studies using gadolinium-DTPA. AJR， 1984,142:625-630.

2 Felix R, Schoerner W, Laniado M, et al. Brain tumors: MR imaging with gadolinium-DTPA. Radiology， 1985,156:681-688.

3 Claussen C, Laniado M, Kazner E, et al. Application of contrast agents in CT and MRI （NMR）: their potential in imaging brain tumors. Neuroradiology， 1985,27:164-171.

4 Grossman RI, Wolf G, Biery D, et al. Gadolinium enhanced nuclear magnetic resonance imags of experimental brain abscess. J Comput Assist Tomogr， 1984,8:204-207.

5 Car DH, Brown J, Leung AW, et al. Iron and gadolinium chelates as contrast agents in NMR imaging: preliminary studies. J Comput Assist Tomogr，1984,8:385-389.

6 Runge VM, Schoerner W, Niedorf HP, et al. Initial clinical evaluation of gadolinium-DTPA for contrast-enchanced magnetic resonance imaging. Magn Reson Imaging，1985,3:27-35.

7 Strich G, Hagan PL, Gerber KH, et al. Tissue distribution and magnetic resonance spin lattice relaxation effects of gadolinium-DTPA. Radiology， 1985,154:723-726.

8 Barnhart JL, Kuhnert N, Bakan DA, et al. Biodistribution of GdCl3 and Gd-DTPA and their influence on proton magnetic relaxation in rat tissues. Magn Reson Imaging， 1987,5:221-231.

9 Carr DH, Graif M, Niendorf HP, et al. Gadolinium-DTPA in the assessment of liver tumors by magnetic resonance imaging. Clin Radiol， 1986,37:347-353.

10 Laniado M, Weinmann HJ, Schorner W, et al. First use of Gd-DTPA/ dimeglumine in man. Physiol Chem Phys Med NMR， 1984,16:157-165.

11 Kabalka GW, Buonocore E, Hubner K, et al. Gadolinium-labeled liposomes containing paramagnetic amphipathic agents: targeted MRI contrast agents for the liver. Magn Reson Med，1988,8:89-95.

12 Barsky D, Putz B, Schulten K, et al. Theory of paramagnetic contrast agents in liposome systems. Magn Reson Med， 1992,24:1-13.

13 Vion-Dury J, Masson S, Devoisselle JM, et al. Liposomemediated delivery of gadolinium-diethylene triaminopentaacetic acid to hepatic cells: a P-31 MNR study. J Pharm & Experi Ther， 1989,250（3）:1113-1118.

14 Jun-ichi K, Ken-ichi I, Ryohei H, et al. Mannan-coated liposome delivery of gadolinium- diethylene triaminopentaacetic acid，a contrast agent for use in magnetic resonance imaging， 1992,40（9）:2565-2567.

15 Tilcock C, Unger E, Cullis P， et al. Liposomal Gd-DTPA: preparation and characterization of relaxivity. Radiology， 1989,171:77-80.

16 Zuidam NJ. Sterilization of liposomes by heat treatment. Pharm Res， 1993,10（11）:1591.