虎杖PcPKS1基因RNAi载体的构建

摘要：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）是富含芳香族聚酮化合物的药用植物，Ⅲ型聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）对芳香族聚酮化合物的合成起重要作用。为了研究虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因PcPKS1的功能，分别选取PcPKS1基因的编码区保守序列（574 bp）和3′端非编码区特异序列（209 bp）作为干扰片段。将选定的干扰片段，分别以正向和反向插入到pYLRNAi 载体中GUS基因内含子的两侧，以形成hpRNA表达盒，成功构建了以组成型CaMV35S为启动子，以潮霉素抗性为筛选标记的RNA干扰表达载体pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR，并将载体导入农杆菌LBA4404中。

关键词：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）；III型聚酮合酶；查尔酮合酶；RNA干扰；转基因

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2255-05

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）为蓼科蓼属多年生草本植物，也是富含芳香族聚酮化合物的药用植物[1]。聚酮化合物是一大类抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫并具免疫抑制剂活性的天然产物。聚酮化合物通常在聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）的作用下生成。聚酮合酶可以分为3类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS[2]，其中III型PKS即查尔酮合酶（Chalcone synthase，CHS）超家族主要分布于植物界。自从1983年第一个植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族成员查尔酮合酶基因被克隆以来，植物III型PKS不断被克隆和鉴定，序列分析表明他们之间氨基酸序列相似性在60%以上，编码约400个氨基酸的蛋白质[3]。Ma等[4]从虎杖中克隆得到一个III型PKS基因PcPKS1，该基因含有3个内含子，BLAST分析发现，PcPKS1与其他植物来源的PKS基因具有80%～99%核苷酸序列的相似性[5，6]。体外酶活试验研究表明，PcPKS1是一个具有查尔酮合酶（CHS）和苯亚甲基丙酮合酶（BAS）活性的双功能酶[5]，但PcPKS1在植物体内的生物学功能研究鲜有报道。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由靶基因同源双链RNA引发，在动植物和真菌中普遍存在序列特异的转录后基因沉默现象。按双链RNA（dsRNA）产生途径将RNAi技术分为多种，其中以具有反向重复序列的hpRNA载体结构在转录过程中形成稳定的dsRNA抑制基因表达的效率较高[7]。RNAi技术已成为功能基因组学研究、动植物性状改良和疾病基因治疗的强有力工具[8，9]。

虎杖富含芳香族聚酮化合物，存在多种Ⅲ型PKS基因来合成这些复杂多样的化合物，深入研究虎杖中聚酮类化合物的生物合成与代谢途径将为人们更合理地利用虎杖的药物资源和基因资源提供参考。本研究从反向遗传学入手，选取位于PcPKS1基因的编码区保守序列（574 bp）和3′端非编码区特异序列（209 bp）为目标序列，以载体pYLRNAi作为骨架载体，分别构建能形成hpRNA结构的RNAi表达载体，为进一步鉴定PcPKS1基因的生物学功能和虎杖功能基因组学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 野生虎杖植株由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心提供。

1.1.2 菌株和载体 根癌农杆菌LBA4404和潮霉素抗性的双元表达载体pYLRNAi由华南农业大学植物基因组学与生物技术重点实验室提供。

1.1.3 试剂 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体购自TaRaKa公司。总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司。

1.2 方法

1.2.1 虎杖叶片总RNA的提取及反转录 以野生虎杖叶片为材料，采用Trizol法提取总RNA，用cDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录成cDNA备用，按试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 干扰片段的选择 根据PcPKS1基因的保守区和特异区序列分别设计2个干扰片段（图1），用于后续2个RNAi载体的构建。将NCBI中PcPKS1基因（登录号：EF090266）的序列进行Blast比对，查找PcPKS1基因的保守区域，选择编码区605～1179 间长574 bp的序列作为第一个干扰片段，简写为CDS。在3′端非编码区选取长209 bp的特异序列作为第二个干扰片段，简写为UTR。

1.2.3 引物设计 以表达载体pYLRNAi为基础载体（图2），该载体携带强组成型35S启动子和GUS基因内含子（250 bp），具有2个多克隆位点MCS1和MCS2，可用于干扰片段的正反向插入。在正向片段引物两端分别加上BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，反向片段引物两端分别加上Mlu Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点。共设计4对引物，引物序列如表1所示。针对PcPKS1基因编码区，设计引物CDS-1和CDS-2扩增正向干扰片段CDSf，设计引物CDS-3和CDS-4扩增反向干扰片段CDSr。针对PcPKS1基因3′端非编码区，设计引物UTR-1和UTR-2扩增正向干扰片段UTRf，设计引物UTR-3和UTR-4扩增反向干扰片段UTRr。

1.2.4 干扰片段的克隆与测序 采用25 μL反应体系，PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸5 min。将正向、反向片段的PCR产物纯化后分别连接pMD18-T载体，将PCR验证正确的阳性重组子进行酶切验证并测序。分别将测序正确的重组子命名为pMD18-CDSf、 pMD18-CDSr、 pMD18-UTRf、pMD18-UTRr。

1.2.5 RNAi载体pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR的构建

1）RNAi载体pYLRNAi-CDS的构建。利用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对测序正确的重组克隆质粒pMD18-CDSf和pYLRNAi进行双酶切，用回收的片段作正向连接，16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取长出的单菌落进行PCR检测。检测出的阳性克隆摇菌提取质粒，将提取出的质粒和测序正确的pMD18-CDSr进行MluⅠ和Pst Ⅰ双酶切，用回收的片段进行反向连接，获得RNAi载体pYLRNAi-CDS（图3A），将其转化大肠杆菌。将已转化大肠杆菌的载体pYLRNAi-CDS进行菌落PCR扩增鉴定和酶切鉴定。

2）RNAi载体pYLRNAi-UTR的构建。方法同上，最终获得RNAi载体pYLRNAi-UTR（图3B）。用CaCl2冻融法将RNA干扰载体pYLRNAi-CDS和 pYLRNAi-UTR分别导入农杆菌EHA105中，用于后期植物转化。

2 结果与分析

2.1 CDS序列的正向片段和反向片段的克隆

以cDNA为模板，用引物CDS-1和CDS-2对正向片段CDSf进行PCR扩增，用CDS-3和CDS-4对反向片段CDSr进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增条带与预期574 bp的片段大小一致，初步表明已获得了CDS序列的正向片段和反向片段（图4）。正向片段CDSf和反向片段CDSr回收纯化后分别连接到pMD18-T载体，对得到的重组质粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr进行双酶切鉴定（图5），均能酶切得到大小约574 bp的片段。测序结果表明，获得的CDS序列的正向片段和反向片段是正确的。

2.2 RNAi载体pYLRNAi-CDS的酶切鉴定

分别用BamH Ⅰ+Hind Ⅲ和MluⅠ+Pst Ⅰ将正向片段和反向片段从重组质粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr上切下来，先后插入到pYLRNAi载体的内含子两侧，得到RNAi载体pYLRNAi-CDS。首先对重组质粒pYLRNAi-CDS 进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌液提取质粒DNA。将阳性重组质粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小574 bp的正义片段；用MluⅠ和Pst Ⅰ酶切则切出大小574 bp的反义片段（图6A）。将重组质粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小约1.4 kb的片段，符合内含子（250 bp）加上正义片段和反义片段长度（图6B）。以上结果表明，RNAi载体pYLRNAi-CDS构建成功。

2.3 UTR序列的正向片段和反向片段的克隆

以cDNA为模板，用引物UTR-1和UTR-2对正向片段UTRf进行PCR扩增，用UTR-3和UTR-4对反向片段UTRr进行PCR扩增，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增条带与预期209 bp的片段大小一致，初步表明已获得UTR序列的正向片段和反向片段（图7）。正向片段UTRf和反向片段UTRr回收纯化后分别连接到pMD18-T载体上，对得到的重组质粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr进行双酶切鉴定（图8），均能酶切得到大小约209 bp的片段。测序结果表明，获得的UTR序列的正向片段和反向片段是正确的。

2.4 RNAi载体pYLRNAi-UTR的酶切鉴定

分别用BamHⅠ+Hind Ⅲ和Mlu Ⅰ+Pst Ⅰ将正向片段和反向片段从重组质粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr上切下来，先后插入到pYLRNAi载体的内含子两侧，得到RNAi载体pYLRNAi-UTR。首先对重组质粒pYLRNAi-UTR进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌液提取质粒DNA。将阳性重组质粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小209 bp的正义片段；用MluⅠ和PstⅠ酶切则切出大小209 bp的反义片段（图9A）。将重组质粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小约660 bp的片段（图9B），符合内含子（250 bp）加上正义片段和反义片段长度。以上结果表明，RNAi载体pYLRNAi-UTR构建成功。

3 讨论

RNAi载体构建过程中，正、反向重复序列间加一段间隔序列（如内含子），在转录后能形成更加稳定的hpRNA结构，显著提高RNA沉默的效率和强度[10]。在本研究中，选择了pYLRNAi载体中的GUS基因内含子序列作为间隔序列，以利于转录后的反向重复序列形成hpRNA。干扰片段的长度影响RNAi的效率，在哺乳动物中，表达的hpRNA双链长度在21～25 nt时，既能引发干扰效应，又不会导致细胞死亡[10]。Wesley等[11]研究发现，植物双链hpRNA长度为98～853 bp的靶基因反向重复片段均能高效地导致基因沉默。

靶基因的位置也影响RNAi构建的效果[12]。一方面，若将靶基因保守区域包含在干扰片段内，就有可能同时沉默一簇基因，这种同时沉默多基因家族的特点，使RNAi在植物功能基因组学研究成为可能[13]；另一方面，选择非保守区域作为干扰片段，则会提高沉默单个基因的效率和特异性[10]。Fukusaki等[14]以矮牵牛查尔酮合酶ThCHS1为靶基因，分别选择610 bp的编码区保守序列和132 bp的3′端非编码区为干扰片段，构建了2个RNA干扰载体CDSi和UTRi，遗传转化结果显示，CDSi转化株系的紫色花色几乎完全消失，花瓣呈纯白色，而UTRi株系的紫色花色只是部分消退，花瓣呈淡紫色，其原因可能是花色由多个查尔酮合酶基因共同调控的，3′端非编码区与同家族基因的同源性较低，针对3′端非编码区设计的RNAi载体UTRi，往往不会干扰其他基因而是特定干扰ThCHS1基因表达，因而导致花色只是部分改变。

在本研究中，经过序列比对分析，选取PcPKS1 基因3′端的非编码区长为209 bp的特异序列作为干扰区段，构建了载体pYLRNAi-UTR，这样保证提高了沉默PcPKS1基因的效率和特异性，为研究PcPKS1基因的功能奠定基础。同时，选取PcPKS1基因编码区长为574 bp的保守序列作为干扰区段，构建了载体pYLRNAi-CDS，期望沉默虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因家族或查尔酮合酶基因家族，为虎杖功能基因组学研究奠定基础。

查尔酮合酶是Ⅲ型聚酮合酶家族的重要成员。查尔酮合酶基因是个多功效基因，可以用于花色修饰[15]和种皮色泽调节[16]，甚至影响植株的育性[17]或激素运输[18]。虽然体外试验表明虎杖PcPKS1具有查尔酮合酶活性[5]，但目前对虎杖中查尔酮合酶基因CHS的功能以及该基因在生物合成途径中的作用了解较少。

4 小结

本研究基于反向调控策略，分别以PcPKS1基因的编码区保守序列和3′端非编码区特异序列为目标序列，成功构建了以组成型CaMV35S为启动子，以潮霉素抗性为筛选标记的RNA干扰表达载体pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR。

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