水提取法和仿生提取法研究水蛭不同炮制品的体外抗凝活性

[摘要]为确定水蛭传统炮制的科学性，分别采用水提取法和仿生提取法提取水蛭清水吊干品、滑石粉烫制品、酒浸闷烘品中的抗凝活性成分，以活化部分凝血酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、抗凝血酶活性作为活性指标进行抗凝测定，并采用考马斯亮蓝法，测定各炮制品提取物中的蛋白含量以初步解释抗凝活性变化原因。对比发现，采用水提取法时，APTT，PT，TT，抗凝血酶活性4种指标结果均显示，滑石粉烫制或酒浸闷烘后水蛭的抗凝活性降低，活性顺序为清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品，此结果与水蛭不同炮制品水提物蛋白含量顺序一致；而采用仿生提取法时，除滑石粉烫制后APTT缩短外，其他结果均显示炮制使水蛭抗凝活性升高，且活性顺序为酒浸闷烘品>滑石粉烫制品>清水吊干品。仿生提取法与水提取法相比更符合水蛭口服后在人体内的吸收过程，结果更具科学性。所以，传统的炮制方法不仅可以矫味矫臭，还可增强水蛭的抗凝活性作用。

[关键词]水蛭；炮制；仿生提取；抗凝活性

[Abstract]In order to determine the scientificalness of traditionally processed Whitmania pigra， water extraction method and bionic extraction method were used respectively to extract the anticoagulating active components in W pigra hanging dry products， talcum powder fried products and wine immersingbaked products Activated partial thromboplastin time （APTT）， prothrombin time （PT）， thrombin time （TT）， and antithrombin activity were selected as the activity indexes to evaluate the anticoagulant activities of different processed W pigra Then the contents of protein in different processed W pigra were measured by Coomassie brilliant blue method to preliminarily explain the reason of anticoagulant activity changes When water extraction method was used， the results of APTT， PT， TT and antithrombin activity showed that the anticoagulant activities of W pigra were decreased both in talcum powder fried products and wine immersingbaked products， and the activity order was as follows： hanging dried products> wine immersingbaked products>talcum powder fried products This order was same as the protein content order While when bionic extraction was used， APTT was shortened in talcum powder fried products， but all the other results indicated the anticoagulant activities of W pigra processed products were increased， and the activity order was as follows： wine immersingbaked products>talcum powder fried products>hanging dry products As compared with water extraction， the bionic extraction was more similar to the absorption process of W pigra in human digestive system after oral administration and was more scientific Therefore， the traditional processing method can not only modify the taste and smell， but also enhance the anticoagulant activity of W pigra

[Key words]Whitmania pigra； processing； bionic extraction； anticoagulant activity

doi：10.4268/cjcmm20161013

水蛭是一味传统的动物类中药，具有明显的抗凝血作用，近年来广泛用于心脑血管疾病的治疗。《中国药典》2015年版（一部）收录了3种水蛭，分别为水蛭科动物蚂蟥，即宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳叶蚂蟥W. acranulata Whitman[1]。调查显示，临床使用的水蛭95%以上为宽体金线蛭[2]。其常用的处理方法为清水吊干，炮制方法为滑石粉烫制、酒浸闷烘（酒炙）等，其中《中国药典》2015年版（一部）收录的炮制方法为滑石粉烫制[1]。目前研究表明，炮制使水蛭的抗凝活性降低[35]，可能基于此原因，临床应用中多选用其清水吊干品，少数选用滑石粉烫制品。在现有的研究水蛭炮制品抗凝活性的报道中，研究者所采用的提取方法大多为水提取法。而水蛭的抗凝活性成分为蛋白类物质[69]，口服后需经胃肠道消化降解入血发挥作用，因此水提取所得活性成分与水蛭在体内发挥作用的物质可能完全不同。本实验模拟蛋白质在体内代谢的真实过程，以蛋白质在胃肠内消化吸收的实际时间和生理环境对水蛭及其炮制品进行仿生酶解提取，针对不同的凝血途径，选取活化部分凝血酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和抗凝血酶活性作为指标测定其体外抗凝活性，同时与水提取法进行对比，最后采用考马斯亮蓝法测定各提取物的蛋白含量，综合评价不同炮制方法对水蛭抗凝活性的影响，为水蛭炮制提供科学依据。

1材料

DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司）；梅特勒托利多FE20实验室pH计（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；LGPABER型血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）；TU1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

水蛭，市售，清水吊干品，经北京中医药大学中药学院鉴定系杨瑶B教授鉴定为宽体金线蛭W pigra；滑石粉，市售；黄酒，市售，古越龙山牌绍兴黄酒五年陈（浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司）。胃蛋白酶（1∶1万，北京拜尔迪生物技术有限公司）；胰蛋白酶（1∶250，北京拜尔迪生物技术有限公司）；APTT，PT，TT试剂盒（上海太阳生物技术有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，SigmaAldrich）；考马斯亮蓝G250（北京拜尔迪生物技术有限公司）；凝血酶（SigmaAldrich）；纤维蛋白原（来源于牛血浆，北京拜尔迪生物技术有限公司）；95%乙醇、85%磷酸、浓盐酸、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等为分析纯试剂；实验用水为去离子水。

健康日本大耳白兔（雄性），质量约2 kg，符合国家健康一级动物标准，动物许可证号为SCXK（京）20150005。

2方法

21水蛭的炮制

211清水吊干品净制取水蛭清水吊干品，洗净，切段，冷冻干燥24 h后，打粉，过3号筛，得清水吊干品粗粉，-20 ℃密封保存。

212滑石粉烫制将滑石粉置锅内，武火炒至灵活状态时后，加入水蛭的清水吊干品适量，不断翻动，烫至微鼓起时取出，筛去滑石粉，放凉[1]，去离子水快速冲洗去除残存的滑石粉，冷冻干燥24 h后，打粉，过3号筛，得滑石粉烫制品粗粉，-20 ℃密封保存。

213酒浸闷烘取水蛭清水吊干品称重，切段，加黄酒，水蛭黄酒10∶1，拌匀至酒吸尽，闷透，放入40 ℃烘箱中干燥至微变色，质酥脆时取出[1011]，冷冻干燥24 h后，打粉，过3号筛，得酒浸闷烘品粗粉，-20 ℃密封保存。

22水蛭及其炮制品活性成分的提取

221水提取法称取水蛭及其炮制品粗粉各150 g，分别加入10 mL去离子水（抗凝血酶活性测定实验中：取各炮制品粗粉100 g加入5 mL去离子水，其余操作相同），室温下磁力搅拌5 h，15 000 r・min-1离心20 min，取上清液，备用。

222仿生提取法取10 mL人工胃液（人工胃液：9 mL浓HCl，加水定容至1 000 mL），加入胃蛋白酶（酶底比125%[12]），搅拌均匀后分别加入水蛭或其炮制品粗粉150 g（抗凝血酶活性测定实验中：取各炮制品粗粉100 g加入5 mL人工胃液，其余操作相同），37 ℃磁力搅拌3 h（蛋白质在胃内的消化吸收时间）；用pH 1300的NaOH溶液将反应液pH调至胰蛋白酶生理条件（pH 680），加入胰蛋白酶（酶底比75%[12]），37 ℃磁力搅拌2 h（蛋白质在小肠内的消化吸收时间）；将反应样品取出，置于85 ℃的水浴中灭活15 min，自然冷却至室温；以15 000 r・min-1离心20 min，取上清液，备用。

23抗凝活性测定

231血浆制备将健康兔耳缘静脉注射乌拉坦麻醉后，颈动脉取血，与质量浓度为38%的枸橼酸钠抗凝剂（9∶1）混匀后以4 000 r・min-1离心15 min，分离出贫血小板血浆（PPP）。

232APTT测定取PPP 50 μL于测试杯中，分别加入水蛭各样品提取液50 μL，APTT试剂50 μL，测试珠1粒，37 ℃孵育5 min后，立即取出加入37 ℃预温的0025 mol・L-1的CaCl2溶液50 μL，记录凝固时间，同时以试剂空白为参比记录其APTT（其中水提样品以水为空白参比，仿生提取样品以空白酶解液为空白参比。空白酶解液按22项下仿生提取法所述，除不加水蛭粗粉外，其余操作相同）。

233PT测定取PPP 50 μL于测试杯中，分别加入水蛭各样品溶液50 μL，测试珠1粒，37 ℃孵育3 min后，立即取出加入37 ℃预温的PT试剂100 μL，记录凝固时间，同时以试剂空白为参比记录其PT。

234TT测定取PPP 50 μL于测试杯中，分别加入水蛭各样品溶液50 μL，测试珠1粒，37 ℃孵育5 min后，立即取出加入37 ℃预温的TT试剂50 μL，记录凝固时间，同时以试剂空白为参比记录其TT。

24抗凝血酶活性测定[1]

241三羟甲基氨基甲烷盐酸（TrisHCl）缓冲液的配制取02 mol・L-1三羟甲基氨基甲烷溶液25 mL与01 mol・L-1HCl溶液40 mL，加水定容至100 mL，调节pH 740。

242抗凝血酶活性测定取样品上清液100 μL，置试管中，加入含纤维蛋白原05%的TrisHCl缓冲液（临用配制）200 μL，摇匀，置37 ℃水浴中温浸5 min，滴加10 U・mL-1的凝血酶溶液（每4 min滴加1次，每次2 μL，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，并计算抗凝血酶活性。

25蛋白质含量的测定

251BSA标准溶液的制备精密称取1000 mg牛血清白蛋白（BSA），加水定容至10 mL，摇匀，即得质量浓度为10 g・L-1的BSA母液，备用。

252考马斯亮蓝溶液的制备精密称取1000 mg考马斯亮蓝G250，加入95%乙醇5 mL溶解，再加入85%磷酸10 mL，加水定容至100 mL，摇匀，过滤，得质量浓度为010 g・L-1的考马斯亮蓝溶液，备用。

253牛血清白蛋白标准曲线的制作取BSA母液，用水稀释成一系列质量浓度（005，01，02，04，06，08，10 g・L-1），取不同浓度的BSA标准液各50 μL，分别加入4 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，避光反应5 min后立即取出，选取595 nm，测吸光度（空白对照：50 μL水加4 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀后避光保存5 min，测吸光度）。

254水蛭不同炮制品的蛋白含量测定将水蛭各水提取样品与各仿生提取样品均稀释20倍，各取50 μL，分别加入4 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，避光反应5 min后立即取出，选取595 nm，测吸光度。水提取法以水为空白对照（50 μL水加4 mL考马斯亮蓝溶液），仿生提取法以空白酶解液（按22项下仿生提取法操作，除不加水蛭粗粉外，其余操作相同）为空白对照（50 μL空白酶解液加4 mL考马斯亮蓝溶液）。

3结果

31APTT测定

测定水蛭及其炮制品水提物及仿生提取物的APTT，结果见表1。

无论采用水提法还是仿生提取法，与空白组相比，不同炮制品均有显著的抗凝效果，但是炮制前后抗凝活性对比时，不同提取方法显现出明显的差异。

APTT所反映的内源性凝血途径中，水提取法结果显示，2种炮制品较清水吊干品APTT均缩短，表示炮制降低了清水吊干品的抗凝活性。仿生提取法结果显示，滑石粉烫制品较清水吊干品APTT缩短，表示滑石粉烫制使清水吊干品的抗凝活性降低；酒浸闷烘品较清水吊干品APTT延长，表示酒浸闷烘使清水吊干品的抗凝活性升高。

32PT测定

测定水蛭及其炮制品水提物及仿生提取物的PT，结果见表2。

PT所反映的外源性凝血途径中，水提取法结果显示，2种炮制品相比清水吊干品PT均缩短，表示炮制降低了清水吊干品的抗凝活性。而仿生提取法结果中，2种炮制品与清水吊干品相比PT均延长，表示炮制使清水吊干品的抗凝活性升高。

33TT测定

测定水蛭及其炮制品水提物及仿生提取物的TT，结果见表3。

TT所反映的共同凝血途径中，水提取法结果显示，2种炮制品相比清水吊干品TT明显缩短，表示炮制降低了清水吊干品的抗凝活性。而仿生提取法结果与水提取法结果相反，2种炮制品相比清水吊干品TT均大幅延长，表示2种炮制法均显著提高了清水吊干品的抗凝活性，此结果与PT测定结果一致。

34抗凝血酶活性测定

记录各样品消耗凝血酶体积，并计算抗凝血酶活性，结果见表4。

水提取法结果显示，滑石粉烫制后抗凝活性降低，酒浸闷烘品与清水吊干品抗凝血酶活性相同。而仿生提取法结果显示，2种炮制品相比清水吊干品抗凝血酶活性显著提升，表示2种炮制法均提高了水蛭的抗凝活性，且酒浸闷烘优于滑石粉烫制。凝血酶滴定法测定抗凝血酶活性反映了凝血酶催化下纤维蛋白原向纤维蛋白转化的过程，与TT反映的作用途径类似，因此活性顺序与TT测定结果基本一致。但此法测定过程中每次加入的凝血酶体积为2 μL，因此灵敏度不够，在水提法中不足以反映清水吊干品和酒浸闷烘品的差异。

35蛋白质含量测定

以BSA为对照品，采用考马斯亮蓝染色法测定水蛭及其炮制品中（稀释20倍）蛋白质的含量，标准曲线线性回归方程为Y=0383 93X+0046 51（R2=0998 0，n=7）。采用水提取法和仿生提取法所得水蛭及其炮制品中的蛋白质含量（以BSA计），见表5。

采用水提取法时，水蛭不同炮制品中蛋白质含量顺序为清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品。采用仿生提取法时，水蛭不同炮制品蛋白质含量顺序为清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品。

36水蛭及其不同炮制品性状比较

实验中发现，不同炮制方法得到的水蛭粗粉颜色，气味及粉碎难度也有明显不同，结果见表6。

可见，炮制使水蛭更易粉碎，同时很好地矫正了水蛭的浓烈腥味。

4讨论

水蛭发挥抗凝作用的活性成分为蛋白质类物质[68]，因此采用水提取法和仿生提取法所得到的成分将会产生很大的差异，这将对抗凝活性产生决定性的影响。本实验的研究结果表明，采用2种提取方法研究炮制对水蛭抗凝活性的影响时，所得到的结果几乎完全相反。水提取法中，APTT，PT，TT及抗凝血酶活性4种抗凝评价指标均显示，炮制使水蛭抗凝活性明显降低，这一结果与多数采用水提法的研究者所得到的结论相同[35]。而在仿生提取法中，采用滑石粉烫制法时，除反映内源性凝血途径的APTT指标较炮制前缩短外，反映外源性凝血途径的PT与反映共同凝血途径的TT和抗凝血酶活性均较炮制前大幅增加；酒浸闷烘炮制品的4种指标均较炮制前明显延长，明确表示水蛭经此法炮制后抗凝活性升高。

由于水蛭通常以口服形式给药，因此采用仿生提取法所测定的抗凝活性与在人体内发挥药效作用的过程更接近，结果也比水提取法更具科学性。对于2种提取方法所得到的抗凝活性结果相悖的情况，可能的原因分析如下。

41滑石粉烫制对水蛭抗凝活性的影响

水蛭在经滑石粉烫制过程中，高温使蛋白质变性失活，水溶性降低[4，13]。因此采用水提取时水溶性蛋白减少，会造成抗凝活性降低。实验中，水提取法所得样品蛋白质含量测定结果表明，炮制后蛋白质的含量明显降低，且蛋白质含量与抗凝活性具有直接的相关性。经过滑石粉烫制后，水蛭中蛋白质高级结构被破坏，结构变得疏松，与炮制前相比变性后的蛋白质一级结构更容易被酶解而释放出活性肽，这与蛋白类食物加热制熟后更易于消化吸收的现象相似，原因可能是酶解反应的存在促进了蛋白质的进一步溶解。反映外源性凝血途径的PT、反映共同凝血途径的TT和抗凝血酶活性均较炮制前升高；但反映内源性凝血途径的APTT有所降低，推测作用于APTT途径的活性物质主要是分子量较大的蛋白质，而作用于其他2种途径的活性物质主要是相对分子质量较小的肽类成分。

此外，采用仿生提取法时，各炮制品抗凝活性顺序与蛋白质含量没有表现出相关性，原因可能是考马斯亮蓝染色法要求标准品与待测样品结构性质相近，水提取法活性物质主要是大分子蛋白质类物质，比较适合采用该法测定；而仿生酶解法活性产物多为相对分子质量较小的肽类物质，与BSA结构性质差异较大，此法所得蛋白含量结果不能有效反映酶解产物中全部蛋白及肽类物质含量。水蛭酶解后抗凝活性增强可能是活性肽含量升高导致，而与蛋白含量没有直接的相关性。

42酒浸闷烘对水蛭抗凝活性的影响

对于水蛭酒浸闷烘品，采用水提取法时抗凝活性也较炮制前有所降低，但活性明显高于滑石粉烫制品。推测黄酒中的乙醇（含量约为15%）使活性蛋白变性，烘干时选取的温度虽远小于烫制的高温，但在某种程度上也会导致蛋白质的变性，温度和有机溶剂的共同影响导致水溶性降低，但其破坏程度远小于滑石粉的高温烫制。蛋白质含量测定结果也表明，酒浸闷烘品的蛋白含量较炮制前降低，但远高于滑石粉烫制品。采用仿生提取法时，结果表示酒浸闷烘使水蛭抗凝活性大幅升高，可能是发挥抗凝作用最好的炮制方法，在此之前有研究者也得出过相同的结论[10]。传统炮制认为酒制可增强药物活血的作用，有文献报道虎杖、丹参、大黄等经酒制后活血作用显著提升[1516]。有研究者指出，黄酒闷水蛭一可矫味、矫臭；二可增强其破血逐瘀通经之功效；三可引药上行，在治疗脑血管疾病方面更能发挥较好的疗效[14]。本实验结果也为酒浸闷烘的炮制方法提供了理论依据。

实验中所使用的黄酒成分复杂，为确定黄酒中的其他成分是否会对体外抗凝活性测定产生影响，将黄酒中液体成分减压蒸干后，剩余的焦糖色素和糖类、氨基酸、维生素等加水复溶（质量浓度与提取所用相同），测定其APTT，PT，TT，其结果与水的凝血时间接近。因此，水蛭酒浸闷烘品的抗凝活性大幅提升与黄酒中这部分成分无关。此外，实验中发现在打开酒浸闷烘品的密封包装后，能闻到明显的醇味，于是进一步对粗粉烘烤（70 ℃）4 h，期间不断翻动，尽可能除去残留的微量乙醇，但处理后仍然可以闻到轻微醇味。而醇的存在会影响凝血酶的活性，导致凝血时间延长。酒浸闷烘品在体内是否也具有最好的抗凝效果有待进一步考证。

43炮制的去腥、矫臭作用

滑石粉烫制法与酒浸闷烘法均能很好地起到去除腥味的作用。而且由于黄酒中含有糖和乙醇，去腥作用更好，酒浸闷烘品不仅没有清水吊干品的浓烈腥味，还具有明显的肉类香味。炮制后，水蛭的腥臭味得到了极大地改善，从而易被患者接受，因此炮制后的水蛭更适合临床应用。

5结论

采用水提取法和仿生提取法研究水蛭不同炮制品的抗凝活性结果几乎完全相反，水提取法显示水蛭经炮制后APTT，PT，TT，抗凝血酶活性均降低。而采用仿生提取法时，滑石粉烫制后除APTT外，PT，TT，抗凝血酶活性均较炮制前显著增加；酒浸闷烘使4个抗凝指标全部较炮制前增加。仿生提取法模拟了胃肠吸收的实际过程，其结果相比于传统的水提取法有更高的可信度。

此外，炮制可使水蛭更易粉碎，同时能够矫臭、矫味，易被患者接受。因此，建议临床上在使用水蛭作为抗凝药时，采用滑石粉烫制或酒浸闷烘法进行炮制，打粉冲服，将取得较好的疗效。

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