6首开心散类方对阿尔兹海默病模型小鼠的药理作用及机制研究

[摘要]该文研究组方相同配比不同的6个开心散类方对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠学习记忆能力的改善作用，以及对阿尔茨海默病模型小鼠海马中的海马中脑源性神经营养因子（BDNF），Tau蛋白，pTau蛋白，Aβ，乙酰胆碱（Ach），乙酰胆碱酯酶（AchE）及血清中N端前脑钠肽前体（NTproBNP）的影响，选用昆明小鼠，腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠，建立阿尔茨海默小鼠模型后，连续灌胃35 d，其中阳性药为石杉碱甲（005 mg・kg-1），各开心散类方给药组高、中、低剂量分别为3570，1785，0892 g・kg-1，采用Morris水迷宫评价各组动物学习记忆能力；Western blot方法检测各组小鼠海马中BDNF的含量；Elisa方法检测各组小鼠海马中Tau蛋白，pTau蛋白，Aβ，Ach，AchE及血清中NTproBNP的含量。结果显示，《千金要方・卷十四》之开心散显著改善AD模型小鼠学习记忆能力，明显升高其海马中BDNF，Ach含量，显著降低其海马中AchE，Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，NTproBNP含量，作用最为全面，在Tau蛋白方面作用较突出；《医心方》之开心散、《医门方》之开心丸、《备急千金要方》之定志小丸和《古今录验》之定志丸对AD模型小鼠各指标的影响各有侧重，部分剂量显著优化了评价学习记忆能力的各项指标，明显升高AD模型小鼠海马中BDNF，Ach含量，显著降低AD模型小鼠海马中Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白含量及AchE活性，明显降低AD模型小鼠血清中NTproBNP含量，作用较为显著；《千金翼》之补心汤的高、中、低剂量均基本未见其对阿尔茨海默病模型动物的影响。结果表明，《千金要方・卷十四》之开心散对阿尔茨海默病模型小鼠的作用最为全面，且在Tau蛋白方面的作用较为突出。

[关键词]开心散类方；阿尔茨海默病；阿尔茨海默病小鼠模型；Tau蛋白

[Abstract]The efficacy of Chinese herbal formulas in treating Alzheimer has been proved in many studies In this study， six different Kaixin San formulas were compared to investigate their effects on learning and memory decline， brainderived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus， tau protein， acetylcholinesterase （AChE） and Nterminal probrain natriuretic peptide （NTproBNP） Kunming mice were selected and established a mouse model of Alzheimer′s by intraperitoneal injection of Dgalactose and sodium nitrite， continued intragastric 4 weeks， using the ability of learning and memory in Morris water maze test to evaluate the animals in each group； the content of BDNF in the hippocampus of mice with Western blotting detected； ELISA method for the detection of each group of mice hippocampal tau protein，pTau protein， Aβ，Ach，AchE and serum NTproBNP levels The results showed that， Kaixin San of Qianjin Yaofang three dose recorded significantly improved learning and memory ability of mice； increased the content of BDNF and Ach in the hippocampus； decreased the content of Aβ， Tau protein， pTau protein in the hippocampus； high， middle dose significantly decreased the serum NTproBNP and AchE in hippocampus， the effect is most significant Part dose of Kaixin San of Yixin Fang， Kaixin Wan of Yimen Fang， Dingzhi Xiaowan of Beji Qianjin Yaofang and Dingzhi Wan of Guji Luyan could improve the learning and memory ability evaluation indicators， significantly increased BDNF and Ach in the hippocampus of AD model mice， reduced the Aβ， Tau protein， pTau protein in hippocampus of AD model mice， decreased the NTproBNP and AchE in serum of AD mice， the effect is more significant Three does of Buxin Tang of Qianjin Yi had no effects of treatment in Alzheimer′s disease The results showed the treatment in AD of Kaixin San of Qianjin Yaofang is the most significant

[Key words]Kaixin San formulas； Alzheimer； Alzheimer disease mouse model； Tau protein

doi：10.4268/cjcmm20160718

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病，其主要临床表现为记忆力减退、认知障碍及人格改变等。据流行病学研究表明，该病的发病阶段与年龄有着一定的联系，而随着我国人口寿命的延长和社会老龄化的加剧，阿尔茨海默病的发病率明显上升，其致死率仅次于心脑血管疾病、肿瘤和脑卒中，成为威胁老人健康的最严重疾患之一[12]。

开心散类方始载于唐代孙思邈的《千金要方・卷十四》，由远志、人参、茯苓、石菖蒲4味药材组成，还包括了《医门方》之开心丸、《备急千金要方》之定志小丸、《古今录验》之定志丸、《医心方》之开心散和《千金翼》之补心汤，主要有益智、调节情志、防老抗衰等功效，其药方组成完全相同但配伍比例不同，功效亦有不同（表1）。 前期的研究表明，6种开心散类方对Aβ2325损伤的 PC12细胞均有保护作用，有潜在治疗阿尔茨海默病的作用，《千金要方・卷十四》之开心散作用最为显著[3]，《备急千金要方》之定志小丸可明显改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍，增强小鼠学习记忆的能力[4]。

AD的发病机制尚不明确，主要有胆碱能学说、β淀粉样蛋白学说、Tau蛋白学说、血管因素学说等。本文将通过观察6种开心散类方对AD模型小鼠的学习记忆能力的影响，以及对与AD可能的发病机制相关学说进行初步探讨，如海马中脑源性神经营养因子（BDNF），乙酰胆碱（Ach），乙酰胆碱酯酶（AchE），Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，血清中N端前脑钠肽前体（NTproBNP）的影响，评价6个类方对阿尔茨海默症模型小鼠的影响。

1材料

健康SPF级昆明小鼠210只，雌雄各半，入组时体重18～22 g，中国人民总医院动物中心提供，合格证号11400700084097。

人参、远志、茯苓、石菖蒲购自北京同仁堂药材有限责任公司，6种开心散类方粉剂均由中国中医科学院中药研究所制剂中心提供，《千金要方・卷十四》之开心散011 g干粉/g生药、《医门方》之开心丸019 g干粉/g生药、《备急千金要方》之定志小丸021 g干粉/g生药、《古今录验》之定志丸023 g干粉/g生药、《医心方》之开心散017 g干粉/g生药和《千金翼》之补心汤021 g干粉/g生药，使用时按比例配成药液；石杉碱甲胶囊（批号130501）由上海复旦复华药业有限公司生产；D半乳糖（批号20140117）购于国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠（许可证号XK1320100153）购于西陇化工股份有限公司；BDNF一抗（货号SC546）购于Senta公司；Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE，Aβ，NTproBNP ELISA试剂盒均购于R&D公司。

Morris水迷宫（上海移数公司）；DNM9602G酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）；3K15低温离心机（美国Sigma公司）；VC150超声破碎仪，涡旋混合仪（SCI logex公司）；UVP凝胶成像系统EC3 Imaging System（美国BIORAD公司）。

2方法

21分组、造模及给药所有小鼠适应环境3 d后，通过Morris水迷宫实验排除个体差异，筛选出170只小鼠（雌雄各半），随机选取10只作为正常组，其余小鼠作为AD模型组。正常组动物腹腔注射等体积生理盐水，模型组动物每日腹腔注射D半乳糖120 mg・kg-1和亚硝酸钠45 mg・kg-1，连续60 d后，将模型小鼠随机分为模型组，阳性对照组，以及6个开心散类方高、中、低剂量组，正常组和模型组每天灌胃25 mL・ kg-1蒸馏水，阳性对照组给药剂量为005 mg・kg-1，各开心散类方给药组高剂量为每天3570 g・kg-1，中剂量为1785 g・kg-1，低剂量为0892 g・kg-1，Morris水迷宫测定期继续给药，共给药35 d。模型组与各给药组给药同时每日进行腹腔注射D半乳糖120 mg・kg-1和亚硝酸钠45 mg・kg-1，正常组腹腔注射等体积的生理盐水。

22Morris水迷宫训练及测试造模60 d后和给药30 d后的第1天至第4天为Morris水迷宫训练，每天训练1次，于第5天进行定位导航试验，利用行为学分析软件记录小鼠60 s内找到平台所需的时间（即逃避潜伏期）；第6天撤出平台，进行空间探索试验，记录小鼠在60 s内穿越原平台所在位置的次数（穿越平台次数）、第3象限（即目的象限）游泳路程及游泳总路程。计算得出目的象限游泳路程百分比=目的象限游泳路程/游泳总路程。

23采集样品及相关物质测定行为学试验结束后，立即对小鼠麻醉进行摘眼球取血，迅速在冰上剥离海马，置于冻存管中，-80 ℃冻存，待测。将血在室温静置一段时间后，4 ℃ 3 000 r・min-1离心10 min，取上层血清置于-80 ℃冻存，待测。Western blot法测定各组动物海马中BDNF的表达水平，用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。将各组蛋白调成等浓度，并加入上样缓冲液，用12% SDSPAGE分离胶和5% SDSPAGE浓缩胶电泳分离后，转移到02 μm BVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗室温摇床90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，用UVP凝胶成像系统得出条带，并计算目的蛋白与内参βacting的吸光度（A）比值；按ELISA试剂盒说明书测定各组动物海马中Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE和Aβ的含量以及各组动物血清中NTproBNP的含量

24数据统计处理实验数据使用SPSS 200统计软件处理，采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnet′s检验，计量资料数据用±s表示，以P

3结果

31对各组小鼠定位导航试验的影响腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠后，模型组小鼠的潜伏期明显升高，与正常组相比有显著性差异（P

32对各组小鼠空间探索试验的影响Morris水迷宫空间探索试验结果显示，腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠后模型组小鼠穿越平台次数和目的象限游泳路程百分比均明显小于正常组（P

33对各组小鼠海马中BDNF含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中BDNF表达明显降低；

与模型组相比，阳性组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组，《医心方》之开心散中剂量组，《医门方》之开心丸中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸高、中剂量组均能不同程度降低AD模型小鼠海马中BDNF相对含量，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（图1）。

34各组小鼠海马中Ach，AchE含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中Ach含量明显降低，具有统计学意义；与模型组相比，阳性对照组，《古今录验》之定志丸中剂量组，《医门方》之开心丸高、中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度升高小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（表3）。

与正常组相比，模型组小鼠海马中AchE含量明显增加，具有统计学意义；与模型组相比，阳性对照组，《古今录验》之定志丸中剂量组，《医门方》之开心丸中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度降低小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，而各组低剂量均未表现出显著性差异（表3）。

35各组小鼠海马中Aβ含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中Aβ含量明显增加，具有统计学意义（P

36对各组小鼠海马中Tau蛋白、pTau蛋白含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中Tau蛋白含量明显增加，具有统计学意义；与模型组相比，

阳性对照组，《医心方》之开心散中剂量组，《医门方》之开心丸高、中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度升高小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（表4）。

与正常组相比，模型组小鼠海马中pTau蛋白含量明显增加，具有统计学意义；与模型组相比，阳性对照组，《医心方》之开心散中剂量组，《医门方》之开心丸高、中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸高、中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度降低小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（表4）。

37对各组小鼠血清中NTproBNP含量的影响与正常组相比，模型组小鼠血清中NTproBNP含量明显增加，具有统计学意义（P

4讨论

本实验采用腹腔注射D半乳糖联合亚硝酸钠模型，D半乳糖可造成急性亚衰老模型，亚硝酸钠可使全身脏器缺氧导致记忆力下降，在一定程度上模拟了AD的发病特点[58]，较多的与AD相关的研究均使用了类似模型，该模型需连续腹腔注射60 d，治疗时连续给药35 d，给药期间持续腹腔注射造模，避免动物自然恢复。本实验造模后动物的行为学研究结果显示，模型组的逃避潜伏期比正常组明显增加，而穿越平台次数和目的象限路程百分比明显减少，并且模型组小鼠普遍出现掉毛、毛色无光泽的衰老现象。给药35 d后，与模型组相比，各给药组逃避潜伏期有所减少，穿越平台次数和目的象限路程百分比有所增加。实验结果中，各类方低剂量与模型组相比均无显著性差异，因此不作为重点研究对象。

AD的发病机制非常复杂，涉及神经营养、胆碱能、β淀粉样蛋白、Tau蛋白、血管因素等多方面。BDNF是神经营养因子家族的一个重要成员，广泛分布于中枢神经系统，脑内BDNF水平下降是AD早期的信号之一[9]；乙酰胆碱（Ach）是中枢胆碱能神经系统主要的神经递质，是维持学习记忆正常进行的必要条件[10]；Aβ的集聚被认为是AD发病的环节之一，多种因素均可导致β淀粉样前体蛋白（APP）的主要代谢途径失衡而产生不溶性Aβ，通过一系列途径产生神经毒性，从而参与AD的病理[11]；以磷酸化Tau蛋白为主要成分的神经元纤维缠结是阿尔兹海默症主要病理表现，同时也是AD中发生认知和记忆功能障碍的重要原因[12]。NTproBNP是心率衰竭常见的检测指标，研究表明，NTproBNP水平升高可能预示着认知功能下降[13]。

本研究除观察6种开心散类方对AD模型动物的学习记忆能力的影响外，还选取了上述较有代表性的相关靶蛋白BDNF，Ach，AchE，Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，NTproBNP进行了作用机制的初步研究。结果表明，6个类方对AD模型小鼠相关靶蛋白均有不同程度的影响，但各有侧重。将相关靶蛋白指标运用主成分分析转化为权重[14]，首先用分析软件得出2个主成分，求出各个指标在各主成分线性组合中的系数，利用各主成分的方差贡献率将系数归一化，由此得出各个指标所占权重。结果显示，BDNF占007，Ach占019，AchE占008，Aβ占019，Tau蛋白占021，pTau蛋白占005，NTproBNP占020，由此得出Tau蛋白所占权重最多，因此，开心散类方治疗阿尔茨海默病模型小鼠的作用在Tau蛋白方面可能较为突出。

6个开心散类方对AD模型动物的作用不同，可能与它们的配伍比例不同、发挥作用的有效成分含量不同有关。《千金要方・卷十四》之开心散人参、茯苓、远志、石菖蒲的比例为1∶5∶1∶25，其重用茯苓与石菖蒲2味药材，表现出较明显的治疗AD效果；与之相比，《医心方》之开心散和《医门方》之开心丸减少了茯苓的配比，治疗AD的效果有所减弱。有研究证实去茯苓开心散对AD模型动物的学习记忆能力没有改善作用或作用减弱[15]；而本实验室前期关于6个开心散类方对抑郁的作用研究中表明《备急千金要方》之定志小丸对抑郁大鼠的影响最为明显，《千金要方・卷十四》之开心散在抑郁动物模型上未见显著的治疗作用，进一步针对入血成分的研究中表明《备急千金要方》之定志小丸的入血成分中人参和远志的有效成分明显较《千金要方・卷十四》之开心散多，说明人参和远志的含量对于抗抑郁作用的发挥至关重要[16]。结合以上分析，本研究中《千金要方・卷十四》之开心散在AD小鼠模型中的作用最佳，且该方重用茯苓和石菖蒲，提示茯苓和石菖蒲可能是其发挥治疗AD作用的主要因素之一，其进一步的作用及机制，需更深入的研究。

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