褐色高温单孢菌PE—211纤维素酶的纯化及固定化研究

摘 要： 本研究望能为其在工业、农业、轻工业等方面的应用提供一定的理论依据。研究方法如下：利用摇瓶培养基进行培养，经硫酸铵盐析、2次SephadexG-100柱纯化，用壳聚糖进行固定化。结果是粗酶液被纯化，以戊二醛为交联剂制备固定化酶，得出结论：褐色高温单孢菌PE-211纤维素酶经硫酸铵盐析、2次SephadexG-100柱纯化，粗酶液被纯化47.5倍，比活力为54.15 IU/mg，以戊二醛为交联剂制备固定化酶。酶动力学研究表明，固定化酶的最适pH为8.5，最适温度为70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力较高；该酶的耐热性很强，而固定化酶的热稳定性比原酶强；以羧甲基纤维素钠为底物，固定化酶的Km为7.19mg/ml，Vmax为0.132mg/ml·min。

关键词： 褐色高温单孢菌 纤维素酶 固定化

一、前言

在化工资源贮藏量不断减少的今天，通过可再生纤维素资源的生物转化生产葡萄糖和乙醇已成为当前研究的热点[1]-[2]。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，其最大的潜在用途是把纤维素类物质酶法水解成葡萄糖。迄今为止，已有很多关于纤维素酶生产菌株的研究报道[3]-[4]，但其中多数以真菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和木霉（Trichodermareesei）等为研究对象。由细菌、放线菌所产生的中性纤维素酶和碱性纤维素酶，在洗涤剂工业中的应用已引起人们的高度重视[5]-[6]。有关褐色高温单孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）产纤维素酶的性质，黎海彬等[7]-[8]已做了研究，但对该酶的固定化未见有报道。本研究对发酵的粗酶液进行了纯化，再制备成固定化酶，然后对其最适反应温度、pH值、耐热性及米氏常数等进行了研究，望能为其在工业、农业、轻工业等方面的应用提供一定的理论依据。

二、材料和方法

1.实验材料

（1）菌种

褐色高温单孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）[7]。

（2）试剂

分离介质SephadexG-100（德国Phamacia）；羧甲基纤维素钠（美国Sigma）；牛血清白蛋白为进口分装；其余均为国产分析纯或化学纯。

（3）仪器

高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）；紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；核酸蛋白检测仪、梯度仪、恒流泵、自动部分收集仪（上海沪西分析仪器厂）等。

（4）摇瓶产酶培养基

在Hagerdal Medium[3]中加入质量分数为1.0%的微晶纤维素作为碳源。

2.实验方法

（1）蛋白质含量测定

采用Folin-酚法测定蛋白质含量[9]，以牛血清白蛋白（BSA）做标准曲线。

（2）SDS-PAGE[10]

采用垂直板式不连续系统电泳，分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4%，用0.25%（W/V）考马斯亮蓝G-250染色。

（3）壳聚糖的制备[11]-[12]

将虾皮洗净，然后去掉残余的虾肉，用3～4倍量体积的4%的稀盐酸和10%的NaOH反复处理4～5次，每次8～10h，用水洗至中性。所得的白色几丁质加入50%的NaOH，于80℃～100℃下保温处理6～7h后，再水洗至中性，晒干粉碎，过40目筛即得。

（4）粗酶的制备[8]

在装有100ml产酶培养基的500mL三角瓶中接入10ml种子液，于55℃、200r/min下培养24～48h，取培养液以4000r/min的速度离心20min，所得上清液即为粗酶液。

（5）粗酶液的纯化

①硫酸铵沉淀和透析。取粗酶液，加入硫酸铵至30%饱和度，在4℃，10000r/min下离心10min，收集沉淀物，再溶于少量磷酸缓冲液中，透析除盐，制得经硫酸铵沉淀的纯化酶液。

②葡聚糖凝胶层析。葡聚糖凝胶SephadexG-100经充分溶胀后上柱，柱子经0.10mol/L的pH6.0的磷酸缓冲液充分平衡后上样，每6min收集一管，分别测定各管的纤维素酶活。

（6）纤维素酶的固定化[13]-[14]

取一定量的壳聚糖于6%的戊二醛中搅拌2.5h，4℃过夜，然后洗去残余的戊二醛，在交联后的壳聚糖中加入纤维素酶液，室温下搅拌2.0h，于4℃静置过夜，再洗去游离酶，即得固定化酶。

（7）纤维素酶（CMCase）活力的测定及定义[15]

酶活力的测定以羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）作底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，然后用DNS（二硝基水杨酸）法测定还原糖的含量，由还原糖的量来求得酶活力的大小。

取0.5ml适当稀释的酶液，与1.5ml质量分数为0.7%的CMC-Na溶液混合，在65℃下反应30min，取出加入3mlDNS显色液，然后煮沸5min，停止反应，冷却，于分光光度计上530nm处比色（空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变）。

一个酶活单位被定义为在1min内转化底物产生1μmol还原糖（按葡萄糖计）所需的酶量。

（8）固定化酶的动力学

分别在不同的pH及温度下，测定其对酶反应速度的影响，并在不同的底物浓度下测定固定化酶的米氏常数K和V。

三、结果

1.硫酸铵沉淀

发酵粗酶液经离心去除菌体和残渣后，在其上清液中缓慢加入硫酸铵至30%的饱和度，4℃过夜，离心、去除杂蛋白。于上清液中缓慢补加入硫酸铵至80%饱和度，4℃过夜，离心收集沉淀，沉淀物溶于柠檬酸缓冲液中。透析检查无铵离子后，计算其收率为65.73%。

2.第一次SephadexG-100柱层析

经硫酸铵盐析后的透析液加到平衡好的SephadexG-100柱上，再用同样的缓冲液洗脱，洗脱曲线为三个峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ），经检测主要的纤维素酶活力包括在峰Ⅲ中，但SDS-PAGE结果表明还有杂蛋白存在，其纯化倍数为30.87，结果见表1。

3.第二次SephadexG-100柱层析

将第一次洗脱峰Ⅲ合并，进行第二轮SephadexG-100柱层析，纤维素酶活都包括在峰Ⅲ中，SDS-PAGE结果表明酶的纯度很高。将具有纤维素酶活的峰Ⅲ合并，测定每一步纯化操作中的蛋白浓度和酶活力，计算比活力，结果见表1。结果表明，经过SephadexG-100柱纯化后，酶的比活力为54.15IU/mg，提纯倍数为47.50。

4.不同酶量对固定化酶活力的影响

取7份1.5g壳聚糖与戊二醛的交联物，分别加入2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml的酶液，固定化后测定其酶活力，结果见图1。

5.固定化纤维素酶的最适pH

取一定量的固定化酶，分别在pH为5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下测定其酶活力，结果发现固定化酶在pH为8.5时，酶的活力最高，如图2所示。

6.固定化纤维素酶的最适温度

取一定量的固定化酶，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下测定其酶活，结果发现固定化酶在温度为70℃时，酶的活力最高。

7.固定化纤维素酶的耐热性实验

取10份固定化酶和原酶，分别置于70℃的水浴中，每间隔10min取出一管，按上述方法测定其酶活力，连续进行100min，结果如图4所示。

8.固定化酶的米氏常数

用等量的固定化酶与不同的底物浓度于65℃下反应15min，测定其吸收值，用双倒数作图法作图，测定酶的米氏常数和最大反应速度，结果见表2。由双倒数作图可知，以CMC-Na为底物，固定化纤维素酶的Km为7.19mg/ml，Vmax为0.132mg/ml·min，而原酶液的Km为7.27mg/ml。

四、讨论

图1结果表明，随着加入酶量的增加，其酶活力随着增大，但当加入的酶量增加到一定程度时，酶活力增加变得缓慢，这可能是由于在酶的固定化过程中，一定量交联后的载体，其活性基团是一定的，结合位点未被饱和之前，固定化酶的活力会随加入酶量的增加而增大，一旦结合位点被饱和后，再增加加入的酶量却不能增加酶活力。

如图2所示，原酶的最适pH值为9.0，可能由于壳聚糖是阳离子型载体，因而固定化酶的最适pH值比原酶要低。

如图3所示，而且固定化酶的热稳定性较原酶高，在60℃～80℃时酶活力都较高。这表明纤维素酶经固定化后，对热的稳定性明显提高。

图4的结果表明，褐色高温单孢菌纤维素酶的耐热性很强，保温100min后，固定化酶的酶活基本保持不变，而且固定化酶比原酶具有较高的热稳定性，由此可以看出，固定化酶的适应性更强，可广泛应用于工业、农业、轻工业等各个方面。

表2结果表明该纤维素酶在固定化后，其米氏常数略有减小，说明纤维素酶经固定化后，与底物的亲和力有所增加。

五、结语

褐色高温单孢菌PE-211纤维素酶经硫酸铵盐析和SephadexG-100柱纯化后，粗酶液被纯化47.5倍，比活力为54.15IU/mg。酶动力学研究表明，固定化酶的最适pH为8.5，最适温度为70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力较高；该酶的耐热性强，而固定化酶的热稳定性比原酶强；以羧甲基纤维素钠为底物，固定化酶的K为7.19mg/ml，V为0.132mg/ml·min。

有关褐色高温单孢菌PE-211固定化纤维素酶在解决能源危机及可再生资源利用等方面有待进一步研究。

参考文献：

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