蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究

摘 要:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)能产生具有强烈杀虫作用的晶体蛋白(insecticidal crystal protein,ICP),对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等节肢动物,以及动植物线虫、蜱螨等都具有特异性的毒杀活性,而对非目标生物安全。目前,通过现代生物技术和基因工程的方法对苏云金芽孢杆菌进行改造,扩大其杀虫谱,提高杀虫毒力,使多种因素和成分发挥作用,害虫不易产生抗药性,避免了化学农药所带来的环境污染和抗性问题。

关键词:苏云金芽孢杆菌;高毒力;生物防治

中图分类号:S3

文献标识码:A

文章编号:1672-3198(2010)09-0353-02

1 苏云金芽孢杆菌的研究历史

1901年日本学者S.Ishiwata报道了从猝倒死亡的家蚕体内分离出一种杆状细菌,即Bt猝倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp. scotto),从而揭开了人类对苏云金芽孢杆菌的研究史。1911年Berliner报道了从德国苏云金省染病的地中海粉螟中分离出一种杆菌并定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。1927年,Matts再次从地中海粉螟中分离出类似的杆菌并沿用了苏云金芽孢杆菌的名称,这就是现在的模式种苏云金亚种Matts和Berliner(Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis Matts or Berliner)。1938年,第一个苏云金芽孢杆菌商品制剂问世,用于防治地中海粉螟。到1953年Hannay第一次发现苏云金芽孢杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关,并与Fitz-James一起证实了伴孢晶体是一种蛋白质。Dulmage(1970)筛选出对夜蛾科毒力较高的菌株HD-1,并以此建立了标准品的生物测定程序,实现了苏云金芽孢杆菌制剂的标准化。1962年,Barjac等首先根据生理生化反应和鞭毛抗原(H)血清反应的不同,把苏云金芽孢杆菌划分为6个亚群。1967年、1968年Heimpel把形态特征、生化反应、H型和酯酶型结合在一起,提出了产伴孢晶体的细菌分类表。1976年Zakharyon最先提出:质粒可能对伴孢晶体的编码起作用。Debabiov等(1977)证实苏云金芽孢杆菌确实含有质粒,伴孢晶体的形成和质粒有关。同时Goldberg和Mangalit(1977)分离出对双翅目幼虫有特异活性的ONR菌株(subsp. israelensis),成为苏云金芽孢杆菌开拓性研究的起点。1981年Schnepf和Whiteley克隆出苏云金芽孢杆菌的第一个cry基因,并于1985年发表了它的核酸序列,标志着Bt研究跨入了分子生物学时代。1995年Crickmore等提出了新的cry基因分类系统。2004年9月11日,美国能源部的Brettin等在NCBI上公布了Bt 97-27的基因组全序列,标志着对Bt的研究进入了基因组时代。2007年7月发现了cry52和cry53,cry基因已达53类。截止2009年7月,确定并公布的杀虫基因已达400余种。

2 蛴螬的危害现状

2.1 我国蛴螬的发生危害

蛴螬分布广泛,发生遍及全国各地,占地下害虫总虫量的70-80%以上,据粗略统计,全国每年蛴螬危害造成的产量损失达到20%以上。蛴螬危害植物种类多,包括除了水田植物之外的粮食、棉花、蔬菜、油料、糖料、烟草、麻类、牧草、中草药、花卉、草坪及果树、林木等多种植物。发生面积最大、虫量较多的是黄淮海地区,主要危害粮食、油料等作物;危害甘蔗的蛴螬,在广东、广西、福建、四川、云南等地发生普遍;在、新疆、青海、甘肃等省(自治区)蛴螬发生也非常严重。它一般为多个种类混杂发生,生活史多为1-2年或3年一代,危害时间长,从春季到秋季,从播种至收获,咬食植物的幼苗、根、茎、种子及块根、块茎、荚果等。苗期受害,造成缺苗断垄;生长期受害,破坏根系组织,啃食嫩果,使植株矮小变黄,降低产量,影响品质。

2.2 花生蛴螬的危害

蛴螬是花生产区的主要害虫。2003-2004年笔者在河北定州市调查,暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)危害严重,造成花生严重减产,严重地块花生产量不足50公斤/亩;2005-2008年调查,铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)是近几年花生的主要地下害虫,其发生占蛴螬总数的30-45%(未发表资料)。刘广瑞等报道,山东省的花生由于受到蛴螬的危害,每年减产约10万吨,优势种为华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、暗黑鳃金龟。李素娟等报道,2000年河南拓城县一农户每亩只收花生5kg,2002年河南濮阳县一农户每亩只收花生25kg,但空壳占60%以上。2003-2007年江新林对山东菏泽地区农田金龟子成虫的发生进行诱集调查,主要虫种为暗黑鳃金龟、铜绿丽金龟、黄褐丽金龟(A. exoleta)及大云斑鳃金龟(Polyphylla laticollis)。2003-2005年铜绿丽金龟为主要优势虫种,2006、2007年暗黑鳃金龟的数量增加,占总虫量的72.4%。2007年调查田间幼虫发生情况,花生田蛴螬数量最多,虫量为每平方米6.52头。

2.3 草坪蛴螬的危害

近年来,由于草坪草多年生、不翻耕的特点,蛴螬对草坪的危害日益严重,短时间内即可将成片草坪破坏得残缺不全,轻者影响草坪的美观,重者造成草坪大面积枯死;用手轻提,就能揭起大片草坪,并可看到大量的幼虫,由此造成超过60 %的草坪被毁。罗晨2004-2006年在北京及其周边地区对草坪生产基地、绿化草坪、高尔夫球场草坪及运动场草坪地下害虫蛴螬种类和为害进行了调查,华北大黑鳃金龟、黄褐丽金龟和铜绿丽金龟是重要的为害种。徐志宏对高尔夫球场蛴螬种类的调查结果,铜绿丽金龟子是高尔夫球场蛴螬的优势种,中华喙丽金龟子(Adoretus sinicus Burmeister)、蒙古丽金龟子(Anomala mongolia)及四纹丽金龟子(Popillia quadriguttata)为次优势种。

2.4 蛴螬的其他危害

蛴螬对马铃薯、大豆、甘蔗等危害也非常严重。蛴螬咬食马铃薯种子和根茎,造成缺苗断垄,而且在结薯期蛀食块茎,被害伤口容易感染镰刀菌和软腐菌,造成烂薯,使马铃薯减产,品质下降。大豆进入分枝结荚期时,受蛴螬害植株出现叶片发黄、枯死。受害较轻田块的植株表现为零星死亡;受害重的田块全田植株倒伏、枯死,侧根大部分吃光,仅剩主根。因为根部严重受害,造成植株全部倒伏,豆荚呈空瘪状。

甘蔗蛴螬又名蔗龟,对甘蔗的生长造成了极大的危害。以蔗龟的成虫危害严重,成虫咬食甘蔗植株的基部,形成半球形缺口,引起地上部有1-2片叶干枯,若咬食更深,则造成枯心,一般枯心率20-40%,个别达80-90%。甘蔗受害后不再分蘖,蔗芽受害形成缺苗缺株。1-3龄幼虫取食蔗根,并在地下部蛀成孔洞,使蔗株易遇风折倒,影响甘蔗的产量和品质。

3 对蛴螬高毒力苏云金杆菌的筛选

对金龟子防治以往多采用化学防治的方法,但随着其对化学杀虫剂的抗性日益增强,化学防治的方法对其效果甚微;同时金龟子对目前己发现的绝大多数苏云金杆菌菌株的毒素不敏感或低敏感,已商业化的苏云金杆菌杀虫剂对其基本无效。针对这一问题,以金龟子为试虫开展筛选和分离工作,筛选出对金龟子具有高毒力杀虫活性的苏云金杆菌菌株,用以研制开发成高效的金龟子苏云金杆菌杀虫剂,在农业生产中具有极其重要的实际意义。

1977年以色列亚种的发现打破了长期以来认为Bt只对鳞翅目昆虫具有毒杀作用的固有观念,人们开始了苏云金杆菌对其它害虫高毒力菌株的筛选,1983年发现了对鞘翅目马铃薯甲虫有活性的拟步行甲亚种,1991年又发现了对线虫有效的菌株。目前,新菌株、新杀虫特性、新杀虫蛋白及其编码基因的发现和报道层出不穷。到目前为止,其杀虫谱己达到包括鳞翅目、鞘翅目、直翅目、同翅目和膜翅目等522种害虫。因此,筛选具有高毒力杀虫活性的新菌株始终是Bt研究最活跃的领域之一。

在1998年我国筛选出对金龟子幼虫具有杀虫活性的Bt特异性新菌株,在研究上取得了突破性的进展。在河北省的土壤中成功分离获得了一株Bt新分离株HBF-1。研究发现,HBF-1菌株对我国危害严重的铜绿丽金龟、黄褐丽金龟等金龟子类害虫具有较高的杀虫活性,尤其对1-2龄的黄褐丽金龟的幼虫杀虫效果可达到100%。

4 高毒力苏云金杆菌的应用现状

Bt作为生物杀虫剂经历了三个发展阶段:1980年以前,Bt杀虫剂主要是利用自然菌株生产的第一代Bt,以质粒接合转移和质粒消除方法而生产出的Foil等为第二代;通过基因工程方法构建的第三代Bt问世。不断发现的Bt基因,正在帮助人类将Bt变成活性高、杀虫范围广的生物杀虫剂。Bt生物杀虫剂在应用过程中暴露出一些局限性,如毒力不强、杀虫谱窄、持效期和货架期短、害虫产生抗性等。利用基因重组和基因异源表达等技术,可以扩大杀虫谱,延长持效期并改善释放性能和提高毒力等。

目前商品化的Bt杀虫剂主要源自库斯塔克亚种,如HD-1及类似菌株。将cry1C基因导入这类菌株后,可扩充其对甜菜夜蛾等昆虫的活性。开发出的产品或制剂有美国的Cutlass和我国的WG系列、Bt-TnY。cry3A基因也被导入库斯塔克亚种,扩充其对鞘翅目昆虫的毒力,如美国的Foil和SAN418以及我国的803-1(3A)和UV-17(3A)。我国也已研制出将cry1Ac导入杀鞘翅目Bt菌株的广谱重组杀虫剂LCJ-12等。

5 防治蛴螬的高毒力苏云金杆菌的发展与展望

5.1 昆虫病原细菌防治金龟子

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前世界上应用最广泛的昆虫病原微生物,上世纪80年代前主要用于防治鳞翅目和双翅目害虫。在国内,1998年冯书亮等分离获得苏云金杆菌HBF-1菌株,对黄褐丽和铜绿丽金龟表现出较高的杀虫活性,这是我国首次发现并报道的对金龟子幼虫具有杀虫活性的Bt菌株。HBF-1菌株悬浮剂防治花生田金龟子幼虫的田间小区试验结果表明,50倍液的虫口减退率为71.4%-75.4%,保果效果为58.7%-72.9%。

乳状菌仅在金龟幼虫中被发现,属于专性寄生病原体,是由金龟子芽孢杆菌Paenibacillus popilliae(A型)和缓死芽孢杆菌Paenibacillus lentimorbus(B型)引起的,由于罹病的幼虫体征呈现特殊的乳白色(Milky disease),称之为乳状菌。1940s-1960s,在美国大规模培养乳状菌用来防治日本丽金龟取得了良好的控制效果。以活体繁殖技术生产的专利产品有“Doom”、“Sapidemin”、“Milky spore”等,但是,乳状菌的生产有许多问题有待解决,如活体繁殖生产菌剂成本高,离体大量生产菌剂技术尚未完全解决,因而限制了它的广泛使用。沙雷氏菌(Serratia spp.)是一种非产孢的病原细菌,嗜虫沙雷氏菌Serratia entomophila和变形斑沙雷氏菌S. proteamachulans可以引起蛴螬的琥珀病。当昆虫取食了沙雷氏菌菌株后,就会停止取食,清空中肠,最终导致死亡。通常在室内饲养的昆虫种群中大量发生。在新西兰,应用S. entomophila或S.proteamachulans处理蛴螬 48 h 后,蛴螬停止取食,72h后虫体出现琥珀般颜色,从而进入慢性发病阶段直至死亡。Jackson 等在应用 S.entomophila 防治褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica幼虫的试验中发现,经过细菌处理的草坪,蛴螬的种群数量减少,并且存活的蛴螬感染琥珀病的比例达79 %;应用S. entomophila154株系处理庭院草坪上的蛴螬,感病率达46 %,并且S. entomophila可以在蛴螬中建立种群优势,减轻蛴螬对草坪的破坏。这一生防技术在新西兰已经应用了十多年。

5.2 防治金龟子的转基因植物的研究

目前商品化的转基因植物中使用的Bt基因主要有cry1Ab、cry1Ab/cry1Ac、cry1Fa、cry3Aa、cry3Bb、cry9C、cry34Ab和cry35Ab等多种,其中对鞘翅目叶甲类害虫高效的基因有cry34Ab、cry35Ab、cry3Aa和cry3Bb等。有报道的在转基因植物中应用的对鞘翅目金龟子类害虫高效的基因有cry8Ca基因和cry8Da基因,但目前还未有商品化生产的报道。

2005年,郎志宏对编码Cry8Ca2蛋白的核苷酸序列进行了改造和密码子优化,优化的mcry8Ca2(modified cry8Ca2) G+C含量由原来cry8Ca2基因的37%提高到46%。构建了植物表达载体pBTmCN、pBSmCN,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化烟草,得到了转化植株。通过对转化植株的检测,证明外源基因己转入烟草基因组中,并在烟草植株中正确表达。将转基因植株接入黄褐丽金龟和铜绿丽金龟幼虫,结果对照植株被蛴螬明显危害,转cry8Ca2基因植株根部生长完好,发育正常,因此cry8Ca2基因可以在转基因烟草中表达,并且对蛴螬有毒杀作用。

转基因植物作为Bt蛋白新的表达系统,具有稳定高效表达的特点。抗金龟幼虫的杀虫蛋白基因转化到植物中,可以使植物的根部组织直接表达杀虫蛋白,并可多价基因表达,当害虫取食后直接作用于害虫的中肠,对害虫的防效是持续稳定的,可以达到控制害虫的目的,提高了防治效果,减少了化学杀虫剂的用量,降低了投入成本,并且对环境无害。因此,利用转Bt基因植物防治金龟子类地下害虫必将成为一条新的有效途径。在这个新的技术领域,需要育种专家和昆虫学家紧密合作,培育抗虫品种,解决关键技术问题,使其切实成为害虫防治的有效措施。

5.3 展望

以上所介绍的苏云金杆菌和转基因植物,有的已开发出制剂并投入田间应用,有的还只在实验阶段,它们的应用效果和开发前景还有待实践去检验,但其所用的策略和思路值得参考和借鉴。随着实践的需要和科学技术的发展,苏云金杆菌杀虫剂将朝着高效、广谱、持效和延缓抗性方向发展,生态杀虫剂也会有较大的发展空间。同时,苏云金杆菌杀虫剂的研究可为转基因植物提供基因来源,从而为持续有效的控制害虫的发生和为害,实现农业生产的可持续发展提供技术手段。

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