百合病毒的多重RT—PCR检测技术

摘要：根据百合（Lilium brownii var. viridulum）常见的黄瓜花叶病毒（CMV）、百合斑驳病毒（LMoV）、无症病毒（LSV）引物序列，设计2组特异引物，以18S rRNA为内参基因，采用多重RT-PCR，2组引物均能扩增得到LMoV和LSV预期大小一致的片段，未检测到CMV，检测结果不受病株取材部位的影响。该方法的建立为百合脱毒苗的规模化生产提供了高效检测技术。

关键词：百合（Lilium brownii var. viridulum）；病毒；多重RT-PCR

中图分类号：S682.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5051-03

Studies on Multiplex RT-PCR Detection on Viruses of Lily

ZOU Ying-chun1，2，YANG Chao-zhu2，QIN Da-ji1，2，ZHAO Qing-hua2，XIANG Ji-qian1，2，YIN Hong-qing1，2，

YANG Yong-kang1，2，HUANG Jian-min1，2，PI Lei1，2

（1. Enshi Qingjiang Bio-Engineering Co.， Ltd.， Enshi 445000， Hubei， China； 2. West Comprehensive Experiment Station of Hubei Provincial Agriculture S&T Innovation Center， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： Based on the primers detecting lily （Lilium brownii var. viridulum） cucumber mosaic virus（CMV）， lily mottle virus（LMoV） and lily symptomless virus（LSV）， two groups of specific primers were designed. Using 18S ribosomal RNA as internal control gene， multiplex RT-PCR method were established to detect the 3 major viruses. LMoV and LSV were detected， but CMV was not detected. This detecting method will promote the large-scale production of the virus-free lily seedling.

Key words： lily（Lilium brownii var. viridulum）； virus； multiplex RT-PCR

百合（Lilium brownii var. viridulum）是百合科百合属多年生草本球根植物，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区。我国栽培的百合种球主要依赖进口，长期的无性繁殖导致优良品种种球带毒严重，部分病毒感染率高达60%[1]。目前，国内外已报道侵染百合的病毒有20余种，其中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus，LMoV）和百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）是目前危害最大的3种主要病毒，它们单独和混合侵染可造成百合切花与鳞茎品质和产量的严重下降[1-5]。对这3种病毒的检测成为种球质量评估的关键，也是后续的分球和组培生产脱毒苗关键技术[6-9]。

目前，常见的百合病毒检测方法有电子显微镜法、血清学方法、分子杂交、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、血清学和PCR相结合的方法以及基因芯片法等。其中，RT-PCR方法被证实是目前特异性最强、灵敏度最高的病毒检测方法，现已广泛应用于病原诊断和检测。而后来发展起来的多重RT-PCR（multiplex RT-PCR）可以一次检测多种病毒，特异性强，灵敏度高，成为百合等常年无性繁殖作物病毒的高效检测方法。近年来湖北省恩施州百合产业发展较快，引进了不少国内外品种，但病毒的检测仍依赖于异地检测。因此，本研究旨在建立百合病毒的多重RT-PCR检测技术，为湖北省恩施州百合产业发展和脱毒种球种苗生产以及疫病监控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

百合病株样本采集自湖北省恩施州双河高山培育基地，均为从荷兰引种的种球种植而成。病株采集参照徐秉良等[10]描述，主要表现为叶片黄斑，凹凸，扭曲，褐化，深绿色斑点，花的症状为褐色斑点，植株症状为矮化。

1.2 试剂

植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，5×M-MuLV反转录酶缓冲溶液、M-MuLV反转录酶、10×Taq Reaction Buffer、Taq DNA Polymerase 均购自Promega公司，dNTPs、10×Loading Buffer、DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3 多重RT-PCR 检测方法确立

用植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取百合叶片和鳞茎总RNA，具体方法依照说明进行。第一组引物和第二组引物分别参照王冲等[1]和徐榕雪等[11]设计而成（表1）。RT-PCR 40 μL反应体系为：总RNA 8 μL，Oligo-d（t）1 μmol/L，72 ℃变性5 min，立即取出置于冰上放置5 min。再依次加入：5×M-MuLV反转录酶缓冲液8 μL，dNTPs 4 mmol/L，M-MuLV 反转录酶40 U，加入DEPC处理过的ddH2O 14 μL。将反应混合物于PCR仪中42 ℃延伸1 h，-20 ℃保存备用。采用25 μL反应体系进行PCR，包括：cDNA，上、下游引物，dNTPs，10×Buffer（含MgCl2），Taq 酶1.25 U，ddH2O补足至25 μL 。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min[5]。以1.5%琼脂糖凝胶检测PCR产物，用凝胶成像系统（Bio-Rad）在标准紫外光下成像。

2 结果与分析

2.1 百合不同组织部位总RNA的提取

植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]分别选取百合叶片和鳞片总RNA， RNA质量较好，完全满足病毒检测（图1）。

2.2 多重RT-PCR检测百合不同组织部位病毒

应用第一组引物，进行多重RT-PCR扩增，获得片段大小分别为240、305 bp，内参基因为197 bp，与预期结果一致（图2）。用第二组引物，对叶片和鳞片组织进行多重RT-PCR扩增，获得片段大小分别为171、428 bp，健康叶片只能扩增出197 bp的内参基因条带，未扩增出非特异性条带（图3）。病毒在植株内部分布均匀，检测结果不受取材部位的影响，可在不同的繁殖时期和生育阶段检测。2组引物特异性均较好，可任选其一。在取样的病株中，部分植株存在 LMoV和LSV单独或混合感染，未检测到CMV感染，可能与病毒的发生普遍率及取材有关。

3 小结与讨论

目前，在侵染百合的病毒中，LMoV、LSV和CMV是报道最多的3种侵染百合的病毒，侵染几率高，分布广，且常常表现出2种或3种病毒的混合侵染。因此，建立多重RT-PCR检测方法十分重要。本研究所用2组检测引物，扩增特异性均非常好，能够良好的分辨出两种病毒和内参基因。第一组引物中所用内参基因的扩增效果很好，能有效消除假阳性。在RNA提取过程中，百合的鳞茎组织致密，在液氮中变得十分坚硬，研磨困难，研磨前需充分破碎，这样的操作可能会对百合RNA的质量产生影响，但并未影响最终的检测结果，证明此方法可行。此外叶片扩增效率大于鳞茎可能受鳞茎研磨不够充分或病毒在鳞茎中分布不均匀所致。因此，为提高检测可靠性，可以加大鳞茎的研磨量并充分研磨。

参考文献：

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[10] 徐秉良，梁巧兰，徐 琼.百合病毒病的发生与症状类型[J].植物保护，2004，30（5）：62-65.

[11] 徐榕雪，明 军，穆 鼎，等.百合三种病毒的多重RT-PCR检测[J].园艺学报，2007，34（2）：443-448.