改良CTAB法提取鸢尾属植物DNA

摘要鸢尾属植物中酚类、多糖含量较高，DNA提取较为困难。在前人工作基础上，改进了提取植物DNA的CTAB方法，通过延长水浴时间、氯仿/异戊醇（24∶1）2次抽提、适当延长氯仿/异戊醇与提取液接触时间等一系列改进，简化了提取步骤，大大缩短了提取时间。所提取的DNA纯度高，可满足以PCR扩增为基础的试验需要。

关键词鸢尾属；DNA提取；改良CTAB法；PCR

中图分类号Q781；S682.1+9文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）08-0031-01

DNAExtractionfromIrisSpecieswithModifiedCTABMethod

LI Cheng-zheLIU Zhan-lin *YANG Hong-chaoHUANG An-lingLIU Fang

（College of Life Sciences，Northwest University，Xi′an Shaanxi 710069）

AbstractDNA isolation of Iris species is difficult for their high contents of polyphenol and polysaccharide.Here a modified CTAB method for Iris DNA extraction was presented.With series of improvement and simplification of the procedure，including water-bath time extension，chloroform/ isoamyl alcohol（24∶1） twice extraction，high concentration and purity of DNA was obtained and it could be used in the following molecular biology experiments based on PCR amplification.

Key wordsIris；DNA extraction；modified CTAB method；PCR

随着分子生物学技术的发展，快速、经济地从植物样品中提取高产量、高纯度的基因组DNA已成为植物分子生物学研究的首要问题。鸢尾属（Iris）植物中酚类、多糖含量较高，DNA提取较困难。目前，提取鸢尾属植物DNA的方法按裂解剂的不同主要分为CTAB法和SDS法。但采用CTAB法[1-2]提取出来的DNA由于产量低、易降解等问题，无法达到预期效果；SDS法[3]虽操作简单、温和，但费时，且不能有效去除多糖和酚类物质[4]。为此，笔者在诸多学者工作基础上对CTAB法提取DNA进行优化，现报告如下。

1材料和方法

1.1试剂和药品

液氮；2×CTAB提取缓冲液（表1）：5 mol/L NaCl，0.5 mol/L EDTA（pH值8.0），1 mol/L Tris-HCl（pH值8.0），β-巯基乙醇；氯仿/异戊醇（体积比为24∶1）；无水乙醇；70%乙醇；双蒸水（ddH2O）。药品均为分析纯。

1.2仪器设备

低温离心机、恒温水浴锅、研钵、微量加样器等。

1.3材料来源

以鸢尾（Iris tectorum）为原材料，其采于西北大学校园。

1.4操作步骤

1.4.1准备工作。具体如下：①将水浴锅温度升至65 ℃；②将CTAB提取缓冲液置于水浴锅中预热；③在-20 ℃冰箱中预冷无水乙醇；④在4 ℃冰箱中预冷70%乙醇。

1.4.2操作要点。具体如下：①称取0.2 g幼嫩叶片置于灭菌干燥钵中，加入约30 mL液氮，轻轻捣碎叶片。等液氮即将挥发完时，快速研磨至粉状（越细越好），把粉末转移至有标号的2 mL Eppendorf管中。②向管中加入800 μL 65 ℃预热的CTAB提取液。③将Eppendorf管置于65 ℃水浴锅中，保温50 min，每隔5 min用手轻微颠倒混匀1次。④取出样品管待冷至室温后，加入700 μL氯仿/异戊醇（24∶1），来回颠倒混匀10 min，动作应轻柔。11 000 r/min室温离心6 min分层。⑤用剪去端部约0.8 cm的1 mL吸头将上清液转移至另一2 mL Eppendorf管中，重复步骤④。⑥用剪去端部的1 mL吸头转移上清液500～600 μL至一1.5 mL Eppendorf管中。⑦向管中加入2倍体积的预冷无水乙醇约1 000 μL，轻轻上下摇动样品管，DNA将从溶液中析出。如样品中DNA含量较少，会观察到管中含有白色悬浮的DNA颗粒；如样品中DNA含量较高，则可观察到白色絮丝状的DNA悬浮于溶液中。⑧将样品管置于低温离心机中12 000 r/min离心10 min，倒上清液，用预冷的70%乙醇400 μL清洗DNA沉淀，室温放置5 min。⑨倒上清液，再加70%乙醇400 μL。静置5 min后，在室温下干燥。⑩干燥后加入100 μL 双蒸水或0.1×TE缓冲液，放在4 ℃冰箱中保存（-20 ℃长期保存）。

2结果与分析

2.1用紫外分光光度计检测DNA含量

分别采用李宇伟等[1]、杜欣[2]、笔者的CTAB法提取DNA，260/280 OD比值分别在3.34～4.71、2.58～3.92、2.15～2.38。260/230 OD比值分别为1.11～1.64、1.30～1.42、1.60～1.64。表明笔者的方法所提DNA中RNA、蛋白等杂质较少。一般来讲，RNA不影响DNA的特性分析，在提取获得的DNA样品管中加入2 μL RNase，即可除去RNA。

2.2用改进方法提取DNA的电泳图样

鸢尾DNA提取液电泳结果如图1所示，7～9在高分子量区的DNA电泳条带最清晰，最整齐均匀，质量较好。

2.3以改进方法提取的DNA为模板进行PCR扩增

由图2可以看出，该法获得的鸢尾DNA可以完全满足PCR扩增的要求。

3讨论

鸢尾叶片含多酚、蛋白质、脂类、多糖和色素等不利于DNA提取的物质，利用常规CTAB法难以获得高质量的DNA。李宇伟等[1]的CTAB法在65 ℃水浴时间是30～60 min，杜欣的CTAB法水浴时间是30 min。但通过试验发现，水浴30 min并不能完全破碎细胞膜和释放DNA。适当延长水浴时间如增至50 min，可使细胞膜裂解较完全，从而释放出更多DNA。李宇伟等[1]采用酚、氯仿多次抽提来除去蛋白质、色素等杂质，但试验表明抽提2次即可，因为抽提次数的重复并不一定改善DNA的纯度，有时反而增加负面作用[5]。杜欣采用氯仿/异戊醇对样品抽提的时间为5 min，而试验发现适当延长氯仿/异戊醇和提取液的接触时间，可减少蛋白质等杂质的干扰，该结果也验证了肖婷婷等[3]的观点。肖婷婷等[3]用CTAB法提取鸢尾DNA时加入异丙醇后置-20 ℃过夜，李宇伟等[1]加入无水乙醇后在-20 ℃静置2 h，而试验表明这一步骤并不是必须的，通过上下摇动样品管，使DNA从溶液中析出，也可以达到相同的效果。该文论述的提取方法对前人的CTAB法进行了优化，具有简便、快速、经济、纯度高、蛋白质和色素污染少等优点，可用于RAPD、ISSR、SSR等以PCR扩增为基础的试验需要。

4参考文献

[1] 李宇伟，王文静，连瑞丽.RAPD法构建鸢尾种质资源的DNA指纹图谱[J].河南农业科学，2008（8）：112-115.

[2] 杜欣.利用ISSR和RAPD分子标记对新疆喜盐鸢尾居群遗传多样性的研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2008：12-13.

[3] 肖婷婷，朱艳，叶波平，等.鸢尾属药用植物总DNA提取方法的比较研究[J].中国野生植物资源，2010，29（3）：46-50.

[4] 易庆平，罗正荣，张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学，2007，35（ 25）：7789-7791.

[5] 李树华，何军，杨淑琴，等.野生稻、野燕麦、枸杞DNA的提取方法[J].干旱地区农业研究，2005，23（3）：166-168.

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