闪式提取法用于紫草的工艺条件研究

[摘要]以左旋紫草素、羟基萘醌总色素的提取率为评价指标，对比闪式提取、回流提取、超声提取对紫草中有效成分的提取效果，采用正交设计综合评分法对闪式提取的工艺参数进行优化。结果表明，闪式提取法提取效率最高，优选的闪式提取最佳工艺为95%乙醇提取3次，每次90 s。在此工艺条件下左旋紫草素、羟基萘醌总色素提取率分别为93.16%，93.89%，出膏率为5.16%。闪式提取法适于紫草有效成分的提取，通过正交试验设计优选的紫草闪式提取工艺稳定、切实可行。

[关键词]闪式提取；紫草；左旋紫草素；羟基萘醌总色素

紫草为紫草属紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst.或内蒙紫草A. guttata Bunge.的根，其主要有效成分为羟基萘醌总色素类，包括乙酰紫草素（acetylshikonin），β-羟基异戊酰紫草素（β-hydro-xyisovalerylshikonin），左旋紫草素（shikonin），β，β′-二甲基丙烯酰紫草素 （β，β′-dimethylacrylshikonin）等。具有凉血、活血、清热、解毒的功效。其中左旋紫草素为其抗炎、抗菌、抗肿瘤的主要活性成分[1-2]。紫草常用油浸（炸）法或用乙醇采取渗漉、回流、超声等方法进行提取，闪式提取法在紫草中的应用未见报道。闪式提取技术作为一种快速提取技术，近年来受到广泛关注，具有快速、高效的特点，而且不需加热、节省能源，与传统提取方法相比具有显著的优势[3-4]。本研究以羟基萘醌总色素和左旋紫草素的提取率及出膏率为指标，探讨了不同提取方法和不同溶剂对羟基萘醌总色素、左旋紫草素提取率的影响。并采用正交设计对闪式提取工艺条件进行了优选，为紫草中有效成分的提取提供了简便、快捷的新方法。

1 材料

JHBE-20A闪式提取器（河南金鼐科技发展有限公司）；BSA224S-C电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；T6紫外分光光度计（北京普析通用有限责任公司）；U3000自动进样高效液相色谱仪（戴安）；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱（杭州爱普仪器设备有限公司）；LDZ5-2离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）。

左旋紫草素（中国食品药品检定研究院，批号110769-200405）；95%乙醇（北京琼洁酒精销售有限公司，批号20101201）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

紫草购自北京仟草中药饮片有限公司，产地新疆，批号090606001，经中国中医科学院中药研究所郝近大研究员鉴定，为A. euchroma。

2 方法与结果

2.1 紫草提取液中羟基萘醌总色素含量测定方法[5]

按照2010年版《中国药典》紫草项下羟基萘醌总色素含量测定方法进行操作，定量量取紫草提取液适量置于量瓶中，用乙醇定容。在516 nm波长下测定吸收值，按左旋紫草素的吸收系数为242计算羟基萘醌总色素的含量。

2.2 紫草提取液出膏率的测定

定量量取相当于1 g生药量的紫草提取液至已称重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置烘箱中于105 ℃烘干3 h，在干燥器中冷却至室温后称重，计算出膏率。

2.3 紫草提取液中左旋紫草素的含量测定[6]

2.3.1 色谱条件 Diamonsil-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-1%甲酸溶液（70∶30），流速1 mL·min-1；检测波长516 nm；柱温25 ℃。色谱图见图1，在上述色谱条件下左旋紫草素分离度良好。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取左旋紫草素对照品0.005 09 g，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品储备液。

2.3.3 供试品溶液的制备 分别取各提取液经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 标准曲线的制备 分别精密移取对照品储备液0.5，1，2，4，8，10 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，分别精密吸取10 μL进样，以峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.180 7x-0.032 7，r=1.000，左旋紫草素在5.09～101.8 mg·L-1线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，以2.3.1项下色谱条件重复进样6次，左旋紫草素峰面积的RSD为0.25%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一份样品溶液，以2.3.1项下色谱条件分别于0，2，4，8，12，24 h进样分析，测得左旋紫草素峰面积的RSD为0.25%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取紫草粉末2 g，精密称定6份，加75%乙醇40 mL闪式提取3次，每次90 s，3 500 r·min-1离心10 min除去药渣，取上清液以2.3.3项下供试品制备方法操作，按2.3.1项下色谱条件测定，左旋紫草素含量的RSD为0.17%，表明方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密移取9份已知含量的提取液6 mL置于10 mL量瓶中，分别加入已知含量80%，100%，120%的质量浓度为0.020 36 g·L-1的对照品溶液，定容，滤过。按2.3.1项下色谱条件测定峰面积，计算加样回收率，结果见表1。

2.4 紫草饮片中左旋紫草素、羟基萘醌总色素含量的测定

精密称取紫草粗粉（过3号筛）0.2 g平行3份，置锥形瓶中，分别加甲醇20 mL，超声30 min（250 W，40 kHz），后补足失重，提取液经0.45 μm滤膜滤过后，按2.3.1项下方法进行测定。紫草中左旋紫草素质量分数为0.017 67%，RSD 1.0%。

精密称取紫草粗粉（过3号筛）0.5 g共3份，按照2.1项下方法测定羟基萘醌总色素的质量分数，结果表明，本试验所用紫草样品中羟基萘醌总色素质量分数为0.88%，RSD 0.10%，药材符合药典规定。

2.5 紫草不同提取方法的比较

为了比较不同提取方法提取紫草的效果，本试验以95%乙醇为提取溶剂，分别对紫草进行闪式提取、回流提取、超声提取，并测定提取液中左旋紫草素和羟基萘醌总色素的含量。

称取紫草粗粉2 g，加入95%乙醇，分别采用闪式、回流、超声等方法提取1次，分别测定提取液中左旋紫草素和羟基萘醌总色素的含量。结果见表2，闪式提取明显优于超声和回流提取，在溶剂用量较低的条件下羟基萘醌总色素和左旋紫草素即有较高的提取率。且闪式提取不需要加热，提取时间很短，具有明显的优势。

2.6 闪式提取工艺条件的优选

2.6.1 试验设计 研究表明，影响闪式提取的因素主要有溶剂、提取次数、提取时间、液固比等[7]，结合预试验结果，本试验选择固定液固比7∶1，以乙醇浓度、提取次数、提取时间为考察因素，在平行操作条件下按照L9（34）正交设计表进行试验，见表3。

2.6.2 试验方法 称取紫草药材粗粉10 g，置于闪式提取器中，每次加入7倍量溶剂，按正交设计表相应条件进行提取，保持相同转速（电压100 V），提取至规定时间，提取液滤过，测定提取液中羟基萘醌总色素、左旋紫草素的含量及出膏率，以上述3个指标的综合评分对结果进行方差分析，结果见表4，方差分析结果见表5。权重系数分别为0.1，0.4，0.5，总分计算公式为综合评分=0.5×X/Xmax×100+0.4×Y/Ymax×100+0.1×Z/Zmax，X为左旋紫草素提取率，Y为羟基萘醌总色素提取率，Z为出膏率。

由表5可知，A，B对结果均有极显著差异，C有显著差异。各因素对指标成分提取效果的影响顺序为B>A>C，即提取时间>乙醇浓度>提取次数。综合以上3个指标的方差分析结果，优选出的最佳工艺为A3B3C3，即应用7倍量95%乙醇闪式提取3次，每次90 s。

2.7 验证试验

按上述提取的最优方案，分别提取3份，测定左旋紫草素和羟基萘醌总色素的提取率及出膏率，结果见表6。结果显示左旋紫草素的提取率为93.16%，RSD 0.49%；羟基萘醌总色素的提取率为93.89%，RSD 1.0%；出膏率5.16%，RSD 0.45%。表明优选的最佳工艺较优，且工艺稳定，重复性好。

3 讨论

本文比较了闪式、回流、超声等提取方法对紫草有效成分的提取率，结果表明闪式提取具有明显的优势。有文献报道，高温对紫草中的有效成分会有一定的破坏[8]，闪式提取具有效率高、速度快、耗能小的特点，在保护有效成分方面也具有一定优势，有较好的应用价值。

[参考文献]

[1] 李治建， 周凡. 紫草药理作用研究进展[J]. 中国中医药信息杂志，2010，17（11）：111.

[2] 李倩， 田春芳， 刘雯霞， 等. 超声波复合酶法提取软紫草多糖的工艺优化[J]. 中国现代应用药学， 2012， 29（6）： 498.

[3] 刘延泽. 植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践[J]. 中国天然药物， 2007， 5（6）： 401.

[4] 朱鹤云， 张丽， 冯波. 超声法与闪式提取法提取龙胆中龙胆苦苷的工艺对比研究[J]. 中国现代应用药学， 2011， 28（5）： 395.

[5] 中国药典. 一部[S]. 2010： 320.

[6] 赵华， 游勇基. HPLC法测定紫草中左旋紫草素和β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量[J]. 海峡药学， 2007， 19（4）： 36.

[7] 任彦飞， 易红， 高进， 等. 微乳闪式提取丹参脂溶性成分研究[J]. 中国实验方剂学杂志， 2011， 17（2）： 15.

[8] 谢秀琼， 邱明丰. 对制剂中紫草成分和提取工艺的探讨[J]. 中国药房， 1997， 8（2）：60.

Studies on flash extraction methods of Arnebia euchroma

MENG Qing-ju1，2， YI Hong1， YANG Hua1， ZHU Li-wei1，2， FENG Jing1，2， LIU Xiao-qian1*

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China）

[Abstract] The extraction of functional components from radix of Arnebia euchroma was optimized using orthogonal design based on the extraction yields of shikonin， and hydroxyl-naphthoquinone pigments. The data processing was carried out with the multiple guidelines grading method for optimizing the extraction condition. Compared with the traditional method （refluxing and ultrasonic extraction）， the flash extraction method was more efficient. The optimal conditions were as follows： 95% ethanol extract 3 times with 90 s for each. Under these conditions， the extraction yields of shikonin， and hydroxyl-naphthoquinone pigments were 93.16%， 93.89%， respectively， and the dry extract rate was 5.16%. In conclusion， the result showed that the flash extraction technology was appropriate， stable and feasible.

[Key words] flash extraction； Arnebia euchroma； shikonin； hydroxy-naphthoquinone pigments

doi：10.4268/cjcmm20131416