小龙虾壳中甲壳素的提取及壳聚糖的制备

摘要：以小龙虾（Procambarus clarkii）壳为原料，分别采用HCl溶液和NaOH溶液处理脱除小龙虾壳中的矿物质和蛋白质，提取甲壳素，用NaOH溶液处理甲壳素脱乙酰基制备壳聚糖。通过单因素试验优化甲壳素提取过程中的HCl溶液浓度及浸泡时间、NaOH溶液浓度及处理时间，并采用正交设计考察NaOH溶液质量分数、处理温度和时间对壳聚糖脱乙酰度的影响。结果表明，优化的甲壳素提取工艺条件为，在室温下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h后倾去酸液，水洗至中性，然后在90～100 ℃用2.0 mol/L的NaOH溶液处理4 h，甲壳素提取率为16.52%。壳聚糖制备的最佳工艺条件为NaOH溶液质量分数50%、温度90 ℃、保温时间3 h。干燥后的壳聚糖水分含量为3.21%，灰分为0.89%～1.00%，脱乙酰度为75.3%，黏度为18.7 mPa·s。

关键词：小龙虾（Procambarus clarkii）壳；甲壳素；壳聚糖

中图分类号：S985.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3120-04

甲壳素（Chitin），又名几丁质，是一种氨基多糖，主要存在于节肢动物如虾、蟹的外壳和真菌及一些藻类植物的细胞壁中，是仅次于纤维素的第二大可再生资源[1]。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，是天然多糖中惟一的碱性多糖，具有许多特殊的物理化学性质和生理功能[2]，被认为是继蛋白质、脂肪、糖类、维生素和无机盐之后的第六大生命要素[3]。目前，甲壳素/壳聚糖及其衍生物在食品、材料科学、医药科学、微生物学、免疫学、农业等方面有重要的应用价值[4]，现已成为最热门的研究领域之一。我国目前加工提取甲壳素和壳聚糖的主要原料是海虾和海蟹壳等[5]，用淡水虾壳制备甲壳素和壳聚糖的报道尚不多见。

小龙虾学名为克氏原螯虾（Procambarus clarkii），也叫红螯虾，是一个淡水小龙虾种，原产于美国东南部，现广泛分布于长江中下游各省市。小龙虾壳为虾仁加工或食用后的废弃物，长期以来未得到很好的利用，既浪费了资源，又污染了环境。因此，以小龙虾壳为原料生产甲壳素类产品具有综合利用资源和保护环境的双重意义[6]。本研究以小龙虾壳为原料，采用酸碱法提取甲壳素，然后将甲壳素脱乙酰基制备壳聚糖，考察不同提取制备条件对甲壳素提取率和壳聚糖质量的影响，确定最佳工艺条件，旨在为虾壳的综合利用提供参考。

1 试验方法

1.1 甲壳素的提取

1.1.1 甲壳素的提取 将收集于荆州市南门某大排档的新鲜小龙虾壳洗净，除去附着物，烘干并磨成粉，取小龙虾壳粉，室温下分别用不同浓度的HCl溶液浸泡，期间不断搅拌，除去虾壳中的矿物质，直至无气泡产生。倾去酸液，水洗至中性；用不同浓度的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反应不同时间，水解除去虾壳中的蛋白质。倾去NaOH溶液，水洗至中性，得甲壳素粗品。甲壳素粗品用5 g/L的KMnO4溶液浸泡1 h，过滤，水洗除去KMnO4后用10 g/L的草酸水溶液于60～70 ℃搅拌进行脱色反应，直至全部变成白色，水洗至中性，于60～70 ℃干燥24 h，得白色的甲壳素。

1.1.2 甲壳素提取条件的优化 设计单因素试验，分别考察甲壳素提取过程中HCl溶液浓度和浸泡时间、NaOH溶液浓度和处理时间对甲壳素提取率及矿物质脱除效果的影响。①HCl溶液浓度。分别采用0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mol/L的HCl溶液浸泡小龙虾壳粉，浸泡时间为24 h，倾去酸液，水洗至中性后用2 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反应3 h，测定灰分含量并计算甲壳素提取率。②HCl溶液浸泡时间。用①优化的浓度的HCl溶液浸泡小龙虾壳粉，分别在室温下浸泡5、10、15、20、25、30 h，倾去酸液，水洗至中性，干燥后称重，计算矿物质脱除率。③NaOH溶液浓度。称取一定量小龙虾壳粉，用HCl溶液脱除矿物质后分别用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反应3 h，去蛋白质，脱色，干燥得甲壳素，计算其提取率。④NaOH溶液处理时间。称取一定量小龙虾壳粉，用HCl溶液脱除矿物质后用③优化的浓度的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中分别反应2、3、4、5、6 h，脱色，干燥得甲壳素，计算其提取率。

1.2 壳聚糖的制备

1.2.1 壳聚糖的制备 称取一定量按优化的工艺提取得到的甲壳素，加入一定浓度的NaOH溶液，煮沸一段时间，使甲壳素在强碱作用下脱去乙酰基，反应一定时间后，水洗至中性，干燥得到浅黄色壳聚糖。

1.2.2 壳聚糖制备条件的优化 设计正交试验，考察NaOH溶液质量分数、处理温度和处理时间对壳聚糖脱乙酰度的影响。正交试验因素与水平见表1。

1.3 指标测定

1.3.1 灰分的测定[7] 将瓷坩埚用20%的HCl溶液煮沸10 min，洗净，放到马弗炉中500～600 ℃下灼烧至恒重，准确称取待测样品1～2 g于坩埚中，在马弗炉内300 ℃灼烧2 h。使其完全炭化，再升温至600 ℃保持2 h，冷却至200 ℃以下，取出置于干燥器中，冷却0.5 h，称重，置于马弗炉中600 ℃灼烧1 h，如此反复，直至恒重。计算样品中的灰分含量。

X=■×100%

式中，X为样品的灰分含量，m1为坩埚与样品的总质量；m2为坩埚与灰分的总质量；m3为灼烧至恒重时的坩埚质量。

1.3.2 矿物质脱除率的测定 分别称取HCl溶液处理前后小龙虾壳粉的干重，计算矿物质脱除率。

矿物质脱除率=（m0-m）/m0×100%

式中，m0为原料小龙虾壳粉的质量，m为HCl溶液处理后小龙虾壳粉的质量。

1.3.3 脱乙酰度的测定[8] 准确称取0.3～0.5 g壳聚糖样品，置于250 mL三角瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，在室温下搅拌至完全溶解。加入5～6滴甲基橙苯胺蓝指示剂，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液变成浅蓝绿色。

A=■×100%

脱乙酰度B=■×100%

式中，A为样品中的氨基含量；C1为HCl标准溶液的浓度；C2为NaOH标准溶液的浓度；V1为加入的HCl标准溶液的体积；V2为滴定耗用的NaOH标准溶液的体积；m为样品质量；w为样品中的含水量；0.016为与1 mL 1 mol/L的HCl溶液相当的氨基量。

1.3.4 黏度的测定[9] 量取100 mL质量分数1%的乙酸溶液，将1 g壳聚糖样品溶于其中，配成1%的壳聚糖溶液，用NDJ79型黏度计直接测定其黏度。

2 结果与分析

2.1 甲壳素提取条件的优化结果

2.1.1 HCl溶液浓度对甲壳素提取的影响 分别用浓度为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mol/L的HCl溶液浸泡小龙虾壳粉，所得甲壳素提取率及灰分含量见图1。由图1可知，随着HCl溶液浓度的升高，甲壳素的提取率呈缓慢下降的变化趋势，而灰分含量先迅速下降，HCl溶液浓度高于1.0 mol/L后灰分含量下降的趋势变得平缓，基本保持不变。可见在一定范围内HCl溶液浓度的升高有助于去除小龙虾壳粉中的矿物质，但HCl溶液浓度高于1.0 mol/L后提高HCl溶液浓度对降低灰分含量的效果不明显，且HCl溶液浓度过高会导致甲壳素的损失，因此后续试验采用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡甲壳素。

2.1.2 HCl溶液浸泡时间对甲壳素提取的影响 取一定量小龙虾壳粉，用1.0 mol/L的HCl溶液在室温下分别浸泡5、10、15、20、25、30 h，倾去酸液，水洗至中性，干燥后称重，计算矿物质脱除率，结果见图2。由图2可知，HCl溶液浸泡时间由5 h延长到20 h，小龙虾壳粉的矿物质脱除率升高速度较快，由20 h延长到25 h，矿物质脱除率升高速度有所减缓，浸泡时间超过25 h后矿物质脱除率基本保持不变，综合客观条件，HCl溶液浸泡时间选择24 h。

2.1.3 NaOH溶液浓度对甲壳素提取率的影响 小龙虾壳粉经HCl溶液浸泡脱除矿物质后用浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反应3 h去蛋白质，所得甲壳素提取率结果见图3。由图3可知，NaOH溶液浓度由0.5 mol/L升高到2.0 mol/L，甲壳素提取率降低，表明甲壳素中的蛋白质等杂质被分解；NaOH溶液浓度在2.0～2.5 mol/L时，甲壳素提取率趋于稳定；之后继续升高NaOH溶液浓度，甲壳素提取率又有所下降，可能是过高浓度的NaOH溶液导致甲壳素被部分水解，综合考虑，NaOH溶液浓度以2.0 mol/L较好。

2.1.4 NaOH溶液处理时间对甲壳素提取的影响 小龙虾壳粉经HCl溶液脱除矿物质后，用2.0 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中分别反应2、3、4、5、6 h，所得甲壳素提取率结果见图4。由图4可知，NaOH溶液处理时间由2 h延长到3 h，甲壳素提取率下降幅度较大，而处理时间由3 h延长到5 h，甲壳素提取率下降的趋势比较平缓，之后再延长处理时间，提取率下降速度又有所加快，可见延长NaOH处理时间有利于蛋白质的分解，但处理时间过长会导致部分甲壳素水解，从而降低提取率，所以处理时间应以4 h为最佳。

综上，从小龙虾壳粉中提取甲壳素的最佳工艺条件为室温下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h，倾去酸液，水洗至中性后用2 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴处理时间4 h，甲壳素提取率为16.52%。

2.2 壳聚糖制备条件的优化结果

壳聚糖的脱乙酰度和黏度是评价其质量的重要指标，对产品的应用范围有重要影响[10]。以按优化的工艺提取的甲壳素为原料，设计正交试验考察NaOH溶液质量分数、处理温度和处理时间对壳聚糖的脱乙酰度的影响，结果见表2。由极差分析可知各种反应条件对壳聚糖脱乙酰度的影响由大到小依次为处理温度、NaOH溶液质量分数、处理时间。方差分析结果表明处理温度和NaOH溶液质量分数对壳聚糖脱乙酰度的影响达显著水平（P

3 小结与讨论

以小龙虾壳为原料提取甲壳素并制备壳聚糖的最佳工艺条件为在室温下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h，倾去酸液后水洗至中性，用2 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反应4 h，脱色后干燥得白色甲壳素，提取率为16.52%。将甲壳素用质量分数50%的NaOH溶液于90 ℃水浴中处理3 h，水洗后干燥得到浅黄色壳聚糖。干燥后的壳聚糖水分含量为3.21%，灰分含量为0.89%～1.00%，脱乙酰度为75.3%，黏度为18.7 mPa·s。

小龙虾壳是制备甲壳素/壳聚糖的良好来源，可以有效解决目前国内加工甲壳素/壳聚糖中存在的加工原料来源有限、生产成本居高和产品质量偏低等问题，为小龙虾壳资源的有效利用及甲壳素/壳聚糖的工业化生产提供了参考。

参考文献：

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