雷公藤内酯与CsA联合抗大鼠异种角膜移植排斥

【摘要】 目的 我们用大鼠异种穿透性角膜移植的动物模型，来研究雷公藤内酯与CsA联合抗移植排斥的效果。方法 我们用豚鼠角膜对Wistar大鼠实施异种穿透性角膜移植术，分别用雷公藤内酯按100μg/kg体重; CsA注射液按15mg/kg体重；雷公藤内酯和CsA注射液联合用药（100μg/kg+10mg/kg）组抗移植排斥反应。根据Holland等建立的临床观察评分法和免疫组化观察疗效。结果 (1)临床观察结果表明，CsA和雷公藤内酯联合用药抗排斥作用优于单独给药（P＜0.01）。(2)观察外周血T细胞亚群的变化发现CD8+细胞的百分数变化联合用药组明显低于CsA或雷公藤单独给药组，CsA组和联合用药组的IL-2R+细胞百分数变化明显低于雷公藤内酯，它们的差别均有统计学意义（P＜0.05）。(3)角膜移植后15天联合用药组植片中淋巴细胞浸润最轻。结论 雷公藤内酯和CsA具有协同抗移植排斥作用。 【关键词】 雷公藤内酯；环孢素A；移植排斥；角膜移植

Combination therapy of triptolide and cyclosporine A resist xenocorneal transplant rejection

【Abstract】 Objective A xencorneal penetrating keratoplasty model was established in Wistar rat and investigated the effect of anti-rejection by combination therapy under CsA and triptolide. Methods After the corneal of Guinea-pig was transplanted into the eye of Wistar rat， we injected 100μg/kg body weight of triptolide， 15mg/kg body weight of CsA and 100μg/kg + 10mg/kg of triptolide and CsA for anti-rejection. The observations on the effect of different anti-rejection agents base the method of Holland and immunochemistry. Results (1)Clinical observation had shown more long-term survival in xenocorneal recipients with combination therapy than triptolide or CsA separating therapy. (2)The changes of percent of CD8+ cell in combination therapy group was less than other therapy groups and percent of IL-2R+ cell in combination therapy group and CsA group was less than triptolide group(P＜0.05).(3)15 days after keratoplasty， there were a few lymphocytes infiltrating the graft cornea in combination therapy group and excel other therapy groups.Conclusion Tiptolide and CsA have a synergetic effect on preventing and treating transplant rejection.

【Key words】 triptolide；CsA；transplant rejection；keratoplasty

历史上，因移植角膜的特惠性生存使眼部被视为具有免疫赦免性的器官之一。最近的研究表明，角膜具有和机体其它器官相似的免疫成分和免疫体系，角膜的免疫赦免是相对的。角膜移植术后，排斥反应的发生率仍为10%～65%，因此和其它组织、器官移植一样，角膜移植排斥是角膜移植术后继发移植失败的最常见的原因，而且有着与前者相似的排斥机制［1］。即：(1)创伤修复和炎症期；(2)移植抗原致敏期；(3)激活免疫活性细胞；(4)移植物（植片）受损期。我们应用大鼠异种穿透性角膜移植的动物模型，研究雷公藤内酯与环孢素A（cyclosporin A，CsA）联合用药抗移植排斥的效果。

1 材料

1.1 实验动物 Wistar 大鼠2～3月龄，180～220g，雄性18只，豚鼠（英国种短毛）2～3月龄，200～230g，雄性9只。由第一军医大学动物实验中心提供，清洁级。

1.2 免疫组化试剂 小鼠抗大鼠T淋巴细胞亚群W/OX系列单克隆抗体MaRTh/i(W3/5)，MaRTc/s(OX-8)，MaR Ia(OX-6)，MaR IL-2R(ART-18），MaR WBC(W 6/32)均由军事医学科学院进口分装。ABC显色试剂盒为Dako公司产品。

1.3 抗排斥药物 雷公藤内酯注射液为福建省药物研究所提供，CsA注射液为瑞士SANDOZ公司产品。

2 方法

2.1 大鼠异种穿透性角膜移植术（右眼） (1)麻醉：2%戊巴比妥钠按1mg/kg腹腔内注射，0.5%地卡因眼液点术眼，2%普鲁卡因0.2ml球后注射。（2）植片制作：豚鼠处死后，0.8%庆大霉素眼液冲洗结膜囊，沿角膜巩缘剪下角膜，以直径4.5mm环钻从内皮面压切成植片。（3）角膜移植：以直径4mm环钻，钻切角膜大深层，以尖刀挑穿后沿钻切口剪下角膜，将植片放置于植床上，11-0尼龙线间断缝合12针，复方NaCl注射液注入形成前房，四环素眼膏涂眼。

2.2 雷公藤内酯、CsA注射液的使用 雷公藤内酯按100μg/kg体重; CsA注射液按15mg/kg体重；雷公藤内酯和CsA注射液联合用药，雷公藤内酯仍按100μg/kg体重，CsA注射液按10mg/kg体重给药，上述各组均每日腹腔注射给药1次。

2.3 临床观察 根据Holland等建立的临床观察评分法［2］，观察得分值为RV(rejection value)，计分标准如下：（1）透明度：0，清亮;1，轻度浑浊；2，浑浊加重，前房清楚可见；3浑浊加重，前房模糊可见；4，全浑浊，前房看不清。（2）水肿： 0，无基质水肿或上皮水肿；1，轻度基质增厚；2，弥漫性基质水肿；3，弥漫性基质水肿合并上皮Microcytic水肿；4，大疱性角膜病变。（3）新生血管： 0，无；1，周边新生血管；2，切口部新生血管；3，植片部新生血管；4，全角膜新生血管。Opton裂隙灯显微镜观察，每隔3天计分一次，动态观察30天。

2.4 免疫组化观察 （1）角膜移植术后第6天、第10天和第15天各组各取1只鼠角膜移植眼球做冰冻切片及免疫组化，方法：①在冰冻切片机中切片。②切片置于0.03%H2O2甲醇中放入真空箱内，在66.7kPa负压下持续10min。③自来水洗，0.01mol/L pH7.2 PBS洗3次，共3min。④加入正常马血清，同②处理。⑤直接分别加入小鼠抗大鼠T淋巴细胞亚群W/OX系列单克隆抗体MaRTh/i(W3/5)，MaRTc/s(OX-8)，MaR Ia(OX-6)，MaR IL-2R(ART-18），和MaR WBC(W6/32)。⑥PBS洗3次同③。⑦加入生物素化羊抗小鼠二抗（1：600），同③。⑧PBS洗3次，DAB显色，HE复染。（2）外周血淋巴细胞亚群分析：2%戊巴比妥钠麻醉Wistar大鼠，心内穿刺取血1.5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液离心（1500r/min，15min）分离淋巴细胞，RPMI1640离心洗3次，调整淋巴细胞悬液浓度为1×105个/ml，取0.1ml涂片，吹干，用丙酮固定1min，PBS洗片。同（1）法作免疫组化。动态观察术前3天，术后3天、9天、15天、21天和30天。

2.5 统计学分析 所有实验数据均用±s表示，用SPSS11.0统计软件作Student-Newman-Keuls test(SNK)分析，两样本均数间进一步作Student’s T-test，分析，P＜0.05为差别有统计学意义。

3 结果

3.1 角膜移植术后的临床观察 动态观察各治疗组间RV变化，随着时间的推移治疗组RV曲线上升趋势比对照组要缓慢，而CsA和雷公藤内酯联合用药组RV曲线上升的最为缓慢（图1）。以RV>7时为发生严重排斥反应的标准，观察对照组发生严重排斥反应的时间为(13.1±1.5)天，而各治疗组达到此RV时间明显长于对照组（P＜0.01），差别有统计学意义。CsA(10mg/kg)和雷公藤内酯(100μg/kg)联合用药抗排斥作用要优于同等剂量的单独给药（P＜0.01），见表1。

图1 大鼠穿透性异种角膜移植临床观察

表1 不同处理组角膜植片发生严重排斥反应的时间 (RV>7，±s)

3.2 角膜移植前后各治疗组外周血T细胞亚群的变化 在角膜移植前3天，后15天两时间点比较各治疗组外周血T细胞亚群的变化时，发现CD4+细胞的百分数变化各组间差别无统计学意义，CD8+细胞的百分数变化各治疗组明显低于对照组，而联合用药组又明显低于CsA或雷公藤单独给药组。IL-2R+细胞百分数变化各治疗组也明显低于对照组，它们的差别均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 角膜移植后各治疗组间外周血T细胞亚群变化（X1-X2）%的比较 (±s)

# Note: The changes of CD8+ cell：2，3 and 4 VS. 1，*P＜0.05; 4 VS.2 or3，**P＜0.05.The change of IL-2R+ cell 2，3 and 4 VS. 1，#P＜0.05.

3.3 角膜移植后植片的免疫组化观察 各治疗组术后15天植片中淋巴细胞浸润均明显少于对照组，其中联合用药组和CsA组又少于雷公藤内酯组，从浸润植片中T细胞亚群的比例来看，对照组CD4+ :CD8+ :IL-2R+ :Ia+均在1.2:1:1:1，而雷公藤内酯组则以CD4+和Ia+细胞浸润为主，联合用药组浸润淋巴细胞略少于CsA组类似于术后第8天时对照组的情况，植片中主要为少量的Ia+细胞（见图2）。

Note:A.Normal，B.Control，C.Triptolide，D.CsA，E.Triptolidet+CsA.

图2 各治疗组术后15天植片中淋巴细胞浸润情况

4 讨论

1979年，Coster等用CsA延长了同种角膜移植植片的存活期。这样CsA作为无骨髓毒性、有选择性地抑制Th细胞活化的免疫抑制剂，成为目前临床上最常用的抗排斥药物之一。许多器官移植的成功显然与其应用密不可分，但仍存在疗效有限和因免疫功能的抑制易导致感染、肿瘤的发生，长期使用还会造成肝、肾和骨髓损害及代谢紊乱等［3］。近年来，已证明雷公藤具有免疫抑制作用，用于器官移植可降低慢排斥反应发生率。此外，其还有一定的抗菌、抗肿瘤作用，但其使用剂量过大时，也会出现严重的毒副作用如心、肝、肾和生殖等组织器官的损害［4，5］。

我们选用雷公藤内酯和CsA联合用药基于CsA可抑制正常淋巴细胞中多种淋巴因子的mRNA转录但不抑制IL-2R合成和T细胞受体识别抗原，并对经细胞膜的信号转导无作用，而雷公藤主要是抑制Th细胞的增殖，同时抑制Th细胞产生IL-2而影响Tc细胞分化增殖并明显抑制丝裂原或抗原刺激下的淋巴细胞表面IL-2R表达［6］。由此说明雷公藤和CsA在作用机制上可以互补。本实验在角膜移植术后注射15mg/kg体重组临床疗效明显，血中Th/i细胞变化不大，角膜免疫组化片中浸润淋巴细胞Th/i细胞比例相对略低。血和角膜组化片中Tc/s和IL-2R+细胞比例也均较低，进一步表明CsA比雷公藤内酯有更突出的抑制Th/i细胞作用。雷公藤内酯组，在角膜移植术后的大鼠血中有IL-2R表达受抑制阶段，角膜组化片中IL-2R+细胞有一定的减少。而10mg/kg CsA和100μg/kg雷公藤内酯组，在降低1/3 CsA用量的情况下仍然能达到标准CsA用量的疗效，这说明雷公藤内酯和CsA有协同作用。

据报道，以200～400μg/kg剂量给大鼠注射雷公藤内酯，每天1次连用10天，其血红蛋白、血小板、谷丙转氨酶及尿素氮等均无明显影响。我们也曾对大鼠按100μg/kg注射雷公藤内酯，每天1次连用30天，光镜下观察未见肝肾损害。因此，在此剂量应用雷公藤内酯与CsA联合用药，雷公藤内酯无明显的毒副作用，而抗排斥的疗效却显著增加，同时也可弥补CsA的长期使用有可能出现的细菌感染和易导致肿瘤的发生之不足。我们认为雷公藤内酯和CsA联合用药如应用到临床，应不失为一种较好的防治移植排斥的方法。

【参考文献】

1 王晶，陶纪值，丁伟，等.T细胞疫苗接种抗异种角膜移植排斥反应的实验研究.医学杂志，1998，23（1）：45-47.

2 Holland EJ. Clinic and immunohistologic studies of corneal rejection in the rat penetrating keratoplasty model. Cornea， 1991，10(5):375-380.

3 Pen I. Cancer after cyclosporine therapy. Transp Proc， 1988，20(suppl):276.

4 Chen H， Chang X， Weng T， et al. A study of microemulsion systems for transdermal delivery of triptolide. J Control Release，2004，98(3):427-436.

5 Fidler JM， Li K， Chung C， et al. PG490-88， a derivative of triptolide， causes tumor regression and sensitizes tumors to chemotherapy. Mol Cancer Ther，2003 ，2(9):855-862.

6 Yang SX， Gan HL， Xie SS， et al. Immunosuppression of triptolide and its effect on skin allograft surrival. Int J Immunopharmacol，1992，14(6):164.