雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

[摘要]根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物，采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA，分析序列同源性，

>> 雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析 雷公藤4―（5′―二磷酸胞苷）―2―C―甲基―D―赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析 雷公藤脚6基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析 雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析 益肾调经方对雷公藤多苷致性腺抑制的肾病大鼠子宫内膜bcl－2／bax基因表达的影响 雷公藤与雷公根的有效区别 雷公藤内酯醇对足细胞EMT相关蛋白mRNA表达的影响 雷公藤的不良反应及中药配伍减毒分析 甲巯咪唑配合雷公藤多苷片治疗甲亢的效果分析 HPLC法测定雷公藤片中雷公藤甲素的含量 环孢素与雷公藤多苷对比治疗中重度湿疹的疗效观察 与青蒿素齐名的雷公藤红素或可治疗肥胖 褐飞虱ABCG基因的克隆与表达分析 类风湿关节炎与雷公藤 杜仲法尼烯基焦磷酸合酶基因cDNA全长的克隆与序列分析 中药雷公藤中的酚性成分研究 雷公藤提取物对白介素的影响 雷公藤红素的长期毒性研究 雷公藤内酯醇对EAE小鼠脊髓IL-10\IFN-γ表达的影响 雷公藤多苷联合他巴唑强的松治疗甲亢突眼61例病例分析 常见问题解答 当前所在位置：l）进行结构域比对。通过TargetP1.1server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行信号肽分析，Psort（http：//psort.hgc.jp/）和Wolfpsort（http：///）进行亚细胞定位分析。利用TRMHMMserverv2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析跨膜结构。通过predictprotein（https：///home）预测蛋白二级结构，SWISS-MODEL（http：///）进行二级结构分析和结构域的三位同源建模。在DNAMAN8.0软件中进行多重序列比对，MEGA5.1软件中建立系统进化树，分析TwMCT进化关系。

2.4TwMCT基因的表达分析选取生长状况良好且一致的雷公藤悬浮细胞作为实验材料，在继代培养第10天，使用50μmol・L-1茉莉酸甲酯诱导悬浮细胞，溶剂DMSO处理的悬浮细胞作为对照，在处理后0，1，4，12，24，48，72h分别取样，用吸水纸吸干，液氮速冻后-80℃保存。每个时间点平行处理3个样品。每个样品的RNA提取，精制参考前述方法进行。以总RNA为模板，参照天根QuantcDNA第一链合成试剂盒说明书，进行反转录，合成cDNA，所得cDNA用于实时荧光定量扩增（RT-qPCR）。依据克隆得到的TwMCT全长序列设计引物，管家基因actin作为内参使用（表1）。为了检测目的基因引物和内参基因引物质量，以0hcDNA为模板，actin引物和RT-MCT引物分别进行普通PCR，电泳检测条带。以cDNA为模板，检测合格的actin和RT-MCT引物，在ABI7500RT-PCR仪上进行RT-qPCR分析。反应体系：10μL2×qPCRMasterMix，0.4μL50×ROXreferenceDyelow，0.4μL引物（10μm），1μLcDNA，加ddH2O补足至20μL。反应条件：初始95℃进行5min，然后扩增循环40次：95℃变性3s，60℃退火延伸33s；然后添加熔解曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。每个样品重复3次，所得数据采用2-ΔΔCt[13]方法计算和分析。

3结果

3.1雷公藤TwMCT基因的全长克隆及序列分析将全长PCR得到的基因序列进行Blast比对和ORFFinder在线分析，结果表明测得的序列与其他物种的MCT基因有较高的同源性并且存在完整的开放阅读框。获得的基因的全长序列共1318bp，开放阅读框位于96～1031bp，推测编码311个氨基酸。Blast结果显示TwMCT序列与梨的同源性达86%，巨桉同源性达85%，萝芙木同源性达82%，葡萄同源性达75%（图1）。TwMCT具有较保守的结构域，在DNAMAN软件中对拟南芥（AtMCT，AEC05588.1），巴西橡胶树（HbMCT，BAF98291.1），丹参（SmMCT，AEZ55666.1），葡萄（VvMCT，XP_002268908.1），巨桉（EgMCT，XP_010030242.1），烟草（NsMCT，XP_009804918.1），大豆（GmMCT，XP_006600265.1），胡黄连（PkMCT，AFM93780.1）的氨基酸序列进行多重序列比对（图1），结果表明TwMCT与其他植物的MCT氨基酸序列具有较大的同源性，平均为71.47%。Interpro结构域比对结果显示TwMCT具有IspD功能域（图2）。

3.2TwMCT氨基酸序列的系统进化分析在MEGA5.1软件中，构建雷公藤与其他植物基于MCT氨基酸序列的系统进化树，大肠杆菌MCT序列作为外类群（图3）。其中低等植物、单子叶植物、裸子植物、双子叶植物聚成单独的分支；TwMCT位于双子叶植物分支类，与大豆MCT聚为一类，二者在亲缘关系较近。

3.3TwMCT氨基酸理化性质和3D结构预测ExPASy在线软件ComputePI/MwTool预测TwMCT蛋白的相对分子质量为34.1kDa，理论等电点8.65。信号肽分析表明TwMCT是非分泌蛋白，无信号肽；亚细胞定位结果显示定位于叶绿体；跨膜域分析显示TwMCT位于膜外，不存在跨膜螺旋。预测TwMCT蛋白的二级结构组成，其中无规则卷曲占55.95%，α-螺旋结构占27.3%，β-折叠占16.7%。蛋白质的功能与其空间结构息息相关，TwMCT蛋白的三级结构建模是以拟南芥[14]MCT同型二聚体为模板（图4）。序列同源性高达78.85%，用于建立该模型的氨基酸去除叶绿体转运肽，为74～311位。

3.4MeJA诱导表达分析对MeJA诱导后0，1，4，12，24，48，72h的雷公藤悬浮细胞进行TwMCT表达量检测分析，目的基因和内参基因的结果中溶解曲线均为单峰，引物特异性强；采用2-ΔΔCt方法分析RT-qPCR实验数据，扩增曲线的Ct介于25～33，引物扩增效率较高。分析数据得到不同时间段MeJA诱导TwMCT相对表达量（图5）。MeJA诱导子能显著提高TwMCT基因的表达量，在24h时表达量最高，是同时间段对照组的2.53倍，随后基因的表达

量逐渐回复，在72h时降至正常水平。

4讨论

萜类化合物是自然界中一大类化合物，由基本的异戊二烯单元以各种方式连接、环化，形成。其结构多样、应用广泛，如橡胶，是工业上不可或缺的重要原料；香叶醇是调香原料，广泛用于配制食品，香皂，化妆品等；青蒿素具有非常显著的抗疟活性，临床上用于治疗疟疾。雷公藤甲素和雷公藤红素是雷

公藤植物中主要的活性成分，具有较强的免疫抑制作用；更重要的是，其抗肿瘤活性也非常突出，是近几年来的研究热点[15-16]。随着市场上对雷公藤的需求量逐渐增大，雷公藤植物分布资源也在逐年减少。尽管在福建、浙江等地建立了若干雷公藤种植基地；但是，雷公藤植物生长年限缓慢，雷公藤甲素等萜类成分作为此生代谢产物在雷公藤植物根中积累量非常低，约40～50μg・g-1[17]。因此，可持续而有效的中药资源开发利用是亟需解决的重大问题。

相比原植物，雷公藤悬浮细胞具有生长速度快，遗传相对稳定的优点；同时能高效合成雷公藤甲素等次生代谢产物[10]。本研究着重于雷公藤悬浮细胞中萜类合成途径MEP途径基因分析，首次克隆得到TwMCT基因。该基因是MEP途径上第3个关键酶基因，对于异戊二烯C5前体的合成有重要作用。生物信息学分析进一步验证了该基因系MCT家族基因，具有IspD功能域，与其他植物的MCT基因有高度同源性。研究发现，MeJA诱导后，TwMCT基因的表达量在诱导后迅速上升。

然而，植物次生代谢过程是非常复杂的，诱导子筛选优化，关键酶基因的克隆，过表达等研究工作仍需进一步深入实施分析。TwMCT全长cDNA的克隆、生物信息学分析、诱导表达分析为研究MEP途径上关键酶基因的调控、功能研究提供了靶基因，从而为深入研究雷公藤甲素类成分次生代谢调控，生物合成及代谢工程奠定了基础。

[参考文献]

[1]高伟，刘梦婷，程琪庆，等.雷公藤的本草考证[J].世界中医药，2012，7（6）：560.

[2]吴春敏.雷公藤化学成分与多组分含量测定研究[D].上海：第二军医大学，2010.

[3]BanerjeeS，SangwanV，McGinnO，etal.Triptolide-inducedcelldeathinpancreaticcancerismediatedbyO-GlcNAcmodificationoftranscriptionfactorSp1[J].JBiolChem，2013，288（47）：33927.

[4]ShaoH，MaJ，GuoT，etal.TriptolideinducesapoptosisofbreastcancercellsviaamechanismassociatedwiththeWnt/β-cateninsignalingpathway[J].ExpTherMed，2014，8（2）：505.

[5]LiM，WangX，LiuM，etal.NF-κBsignalinginhibitionandanticanceractivitiesofLLDT-246onhumancolorectalcancerHCT-116cellsinvitro[J].BiomedPharmacother，2014，68（5）：527.

[6]KimSM，KuzuyamaT，ChangYJ，etal.Cloningandfunctionalcharacterizationof2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatecytidyltransferase（GbMECT）genefromGinkgobiloba[J].Phytochemistry，2006，67（14）：1435.

[7]HsiehMH，ChangCY，HsuSJ，etal.Chloroplastlocalizationofmethylerythritol4-phosphatepathwayenzymesandregulationofmitochondrialgenesinispDandispEalbinomutantsinArabidopsis[J].PlantMolBiol，2008，66：663.

[8]郑玉娟，陈容，周文化.胡黄连2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因的生物信息学分析[J].中草药，2014，45（15）：2218.

[9]刘攀峰.杜仲MEP途径系列基因全长cDNA分离鉴定及序列特征研究[D].北京：中国林业科学研究院，2012.

[10]SuP，ChengQ，WangX，etal.CharacterizationofeightterpenoidsfromtissueculturesoftheChineseherbalplant，Tripterygiumwilfordii，byhigh-performanceliquidchromatographycoupledwithelectrosprayionizationtandemmassspectrometry[J].BiomedChromatogr，2014，28：1183.

[11]胡雅婷，高伟，刘雨佳，等.丹参类贝壳杉烯氧化酶（SmKOL）基因全长克隆及其生物信息学分析[J].中国中药杂志，2014，39（21）：4174.

[12]刘娟，徐艳红，杨勇，等.白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因（AsAACT）的克隆与表达分析[J].中国中药杂志，2014，39（6）：972.

[13]LivakKJ，SchmittgenTD.AnalysisofrelativegeneexpressiondatausingReal-timequantitativePCRandthe2-ΔΔCtmethod[J].Methods，2001，25：402.

[14]GabrielsenM，KaiserJ，RohdichF，etal.Thecrystalstructureofaplant2-C-methyl-D-erythritol4-phosphatecytidylyltransferaseexhibitsadistinctquaternarystructurecomparedtobacterialhomologuesandapossibleroleinfeedbackregulationforcytidinemonophosphate[J].FEBSJ，2006，273（5）：1065.

[15]JiangX，HuangXC，AoL，etal.TotalalkaloidsofTripterygiumhypoglaucum（levl.）Hutchinhibitstumorgrowthbothinvitroandinvivo[J].JEthnopharmacol，2014，151（1）：292.

[16]WongKF，YuanY，LukJM.Tripterygiumwilfordiibioactivecompoundsasanticancerandanti-inflammatoryagents[J].ClinExpPharmacolPhysiol，2012，39（3）：311.

[17]ZhuC，MiaoG，GuoJ，etal.EstablishmentofTripterygiumwilfordiiHook.f.hairyrootcultureandoptimizationofitscultureconditionsfortheproductionoftriptolideandwilforine[J].JMicrobiolBiotechnol，2014，24（6）：823.