检测细胞中1―磷酸鞘氨醇含量的LC―MS/MS分析方法的建立

[摘要] 目的 建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇（S1P）快速、灵敏、特异的LC-MS/MS定量分析方法。 方法 采用C17-S1P作为内参，甲醇一步法进行蛋白沉淀，随后进行正相电喷雾离子化LC-MS/MS分析。流动相为甲醇-0.1%甲酸水（95∶5，v/v），流速0.2 mL/min，每个样品的分析时间为4 min。细胞经TNF-α处理后S1P含量显著增加；而经DMS处理后S1P含量显著下降。 结果 S1P的标准曲线线性范围为0.1～10 ng/mL。相关系数r2均大于0.989。 结论 该方法可以快速，灵敏，特异性地同时检测生物样品中S1P的含量。

[关键词]含量测定；1-磷酸鞘氨醇；液质联用

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）09-09-03

鞘磷脂不仅是细胞膜的主要成分，也可作为信号分子调控多种细胞进程，包括细胞增殖，分化，存活，死亡以及一些细胞的炎症反应[1-2]。几种磷脂类代谢物，特别是鞘氨醇（Sph）和1-磷酸鞘氨醇（S1P）被认为是具有显著生物活性的关键分子，控制着细胞生存和死亡。S1P可以被S1P磷酸酶去磷酸化为Sph。Sph作为负性调节因子，抑制细胞增殖和促进凋亡。相反，S1P作为Sph的磷酸化产物，参与了促进细胞增殖和抑制凋亡过程[3]。目前已有一些方法用于测定生物样品中低丰度的S1P含量。这些方法包括放射性同位素掺入酶促反应实验[4]，放射性受体结合实验[5]，HPLC柱前衍生化[6-7]，质谱[8-9]以及LC-MS/MS等。

在本研究中，我们建立了一种快速，简便，灵敏的LC-

MS/MS分析方法。本方法成功地测定了HEK293细胞中S1P的含量。

1 仪器与试药

Finnigan TSQ Quantum三重四极杆质谱仪（Thermo Electron，San Jose，CA，USA），色谱分析柱为Luna-RP C18色谱柱（150 mm L×2 mm i.d.，5 μm particle size and 100 ? pore size）；外加C18保护预柱（4.0 mm L ×2.0 mm i.d.）（Phenomenex，Torrance，CA，USA）。D-erythro-1-磷酸鞘氨醇（S1P），C17-d-erythro-1-磷酸鞘氨醇（C17-S1P）购自Avanti Polar Lipids（美国）。S1P和C17-S1P的贮存液[DMSO/浓盐酸（100∶2，v/v）]配制，浓度均为100μg/mL。用甲醇配制并于-20℃保存。实验时贮存液用甲醇进一步稀释成工作液。HPLC级甲醇和甲酸购自Tedia公司（美国）。其他所有有机溶剂和化学品均为分析纯级。TNF-α购自BioSource（美国）；二甲基鞘氨醇（DMS）购自Biomol Research Laboratories公司（美国）；超纯水由Milli-Q plus水纯化设备提供（美国）。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

溶剂及样品经Finnigan自动进样器和质谱泵进行分离。柱温为25℃。流动相为甲醇-水（95∶5，v/v）（水中含0.1%甲酸）；流速为0.2 mL/min。每个样品的分析时间为4 min。流动相调控色谱行为和恰当的离子化。为了摸索最优流动相条件，我们研究了不同比例的甲醇，乙腈和水对实验的影响。乙腈能够降低样品的分析时间，每个样品可以在2 min内分析完毕，但峰型比较宽，有一定的脱尾。而增加液相中甲醇的比例可以改善灵敏度和峰型，尽管分析时间长了一些。此外，加入少量甲酸可以提高灵敏度和改善峰型。最终，本实验摸索的最优流动相组成为：95%甲醇和5%甲酸水（甲酸水中含有0.1%的甲酸）。在该流动相条件下，每个样品在4 min内分析完成。

2.2 质谱条件

2.3 细胞培养

人胚胎肾细胞293（HEK293）培养在含10%（v/v）胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，0.2%（w/v）碳酸氢钠，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中。细胞于37℃，5% CO2培养箱中培养，细胞长至汇合状时，采用0.25%胰酶进行消化传代。

2.4 样品收集和制备

2.5 制备标准品

2.6 方法学考察

3 讨论

S1P作为磷脂类小分子化合物，其在生物体内的含量较低。最早人们采用放射自显影技术进行S1P含量测定。该实验采用放射性标记的底物[γ-32P]ATP进行体外酶促反应，随后采用有机溶剂抽提和TLC分离，再用放射自显影方法捕捉产物信号，最后采用液闪仪或磷屏扫描进行定量分析[4]。另一种分析方法涉及到放射性受体竞争性结合实验，该实验通过[3H]S1P与未标记的S1P竞争性与S1P1受体结合[5]。以上这些方法不仅费力耗时，而且难以区分结构相似的化合物，例如S1P和DHS1P。因此，随后人们使用HPLC作为一种替代方法来定量分析S1P以及相关化合物。使用HPLC时，Sph直接转换成其荧光衍生物，而S1P则被碱性磷酸酶去磷酸化转变成Sph，再进行柱前衍生化。随后，荧光衍生物经HPLC分离后被荧光分光光度计检测[5-6，12-17]。尽管HPLC方法避免使用到放射性试剂，但由于其样品提取步骤繁琐，且需要柱前衍生化，不适合大样本分析。

质谱技术是一类分析鞘磷脂代谢产物非常灵敏的分析方法，特别适合生物样本中低丰度S1P的定量分析[18]。质谱技术的成功应用依赖于目标物质能否气化，并且他们产生的离子可以被特异性地检测出来。由于鞘磷脂类分子较容易离子化，而且所产生的碎片离子因其有特异的官能团和骨架结构而较容易鉴定区分[19]，因此磷脂类分子特别适合质谱分析。近来有通过将样品提取液直接注入质谱仪中进行分析的方法，该类方法较之HPLC更为简便和灵敏[8]。不过，由于缺少色谱分离环节，该种方法需要多步提取来尽可能降低诸如等离子干扰以及基质效应的影响，这些因素反过来又使得这种方法存在费力耗时的缺点，限制其广泛使用。LC-MS/MS技术是HPLC和MS技术的完美结合，具有更高的灵敏度，选择性，特异性以及高通量等特点，特别适合大样本分析。

本实验建立并验证了一种运用LC-MS/MS技术测量S1P含量的定量分析方法。该方法采用甲醇一步沉淀法提取，无需样品气化，采用非放射性标记的内标（C17-S1P）来检测生物样品中S1P的含量。流动相组分为甲醇和0.1%甲酸水（95∶5，v/v）。每个样品的分析时间控制在4 min内，可以满足大样本分析的要求。本方法将在研究S1P的生物学效应以及相应靶标药物的筛选方面得到广泛应用。

[参考文献]

[1] Huwiler A，Zangemeister-Wittke U.Targeting the conversion of ceramide to sphingosine 1-phosphate as a novel strategy for cancer therapy[J].Crit Rev Oncol Hematol，2007，63（2）：150-159.

[2] 张丽志，苏健，温克.1-磷酸鞘氨醇对过氧化氢所致微血管通透性增高的影响[J].中国现代应用药学，2013，30（1）：6-9.

[3] Wymann MP，Schneiter R.Lipid signalling in disease[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（2）：162-176.

[4] Edsall LC， Spiegel S.Enzymatic measurement of sphingosine 1-phosphate[J]. Anal Biochem，1999，272（1）：80-86.

[5] Murata N，Sato K，Kon J，et al. Quantitative measurement of sphingosine 1-phosphate by radioreceptor-binding assay[J].Anal Biochem，2000，282（1）：115-120.

[6] He X，Huang CL，Schuchman EH.Quantitative analysis of sphingosine-1-phosphate by HPLC after napthalene-2，3-dicarboxaldehyde NDA）derivatization[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877 （10）：983-990.

[7] 李长勇，姜向明，俞豪，等.高效液相色谱法测定生物样品中磷酸鞘氨醇的含量[J].首都医科大学学报，2008，29（4）：459-462.

[8] Jiang LI，Collins J，Davis R，et al.Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway[J].J Biol Chem，2007，282（14）：10576-10584.

[9] Han X，Cheng H.Characterization and direct quantitation of cerebroside molecular species from lipid extracts by shotgun lipidomics[J].J Lipid Res，2005，46（1）：163-175.

[10] Schmidt H， Schmidt R， Geisslinger G.LC-MS/MS-analysis of sphingosine-1-phosphate and related compounds in plasma samples[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2006，81（3-4）：162-170.

[11] Scherer M，Schmitz G，Liebisch G.High-throughput analysis of sphingosine 1-phosphate， sphinganine 1-phosphate，and lysophosphatidic acid in plasma samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Clin Chem，2009，55（6）：1218-1222.

[12] Min JK，Yoo HS，Lee EY，et al.Simultaneous quantitative analysis of sphingoid base 1-phosphates in biological samples by o-phthalaldehyde precolumn derivatization after dephosphorylation with alkaline phosphatase[J].Anal Biochem，2002，303（2）：167-175.

[13] Caligan TB，Peters K，Ou J，et al.A high-performance liquid chromatographic method to measure sphingosine 1-phosphate and related compounds from sphingosine kinase assays and other biological samples[J].Anal Biochem，2000，281（1）：36-44.

[14] Ribar S，Mesaric M，Bauman M.High-performance liquid chromatographic determination of sphinganine and sphingosine in serum and urine of subjects from an endemic nephropathy area in Croatia[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl，2001，754（2）：511-519.

[15] Butter JJ，Koopmans RP，Michel MC.A rapid and validated HPLC method to quantify sphingosine 1-phosphate in human plasma using solid-phase extraction followed by derivatization with fluorescence detection[J]. J Chromatogr B，2005，824（1-2）：65-70.

[16] Lee YM，Venkataraman K，Hwang SI，et al.A novel method to quantify sphingosine 1-phosphate by immobilized metal affinity chromatography（IMAC）[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2007，84（3-4）：154-162.

[17] Andreani P，Graler parative quantification of sphingolipids and analogs in biological samples by high-performance liquid chromatography after chloroform extraction[J].Anal Biochem，2006，358（2）：239-246.

[18] 关日晴，刘敏敏，李晨辉.液质联用法检测中成药和保健食品中的6种肾上腺皮质激素[J].广东药学院学报，2011，27（2）：151-153.

[19] Merrill JAH，Sullards MC，Allegood JC，et al.Sphingolipidomics： High-throughput， structure-specific， and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Methods，2005，36（2）：207-224.

（收稿日期：2013-04-23）