PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

作者：胥文春，曹炬，许颂霄，罗进勇，朱旦，尹一兵

【摘要】 目的：获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法：分离培养肺炎链球菌TIGR4，获取其染色体DNA，采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET?32(a)内，酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定，镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物，观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果：DNA序列与GenBank中的数据相符，所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA，其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论：重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染，该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.

【关键词】 肺炎链球菌

0引言

肺炎链球菌是引起肺炎、脑膜炎和中耳炎的主要病原菌，疫苗侯选蛋白主要集中在其表面的毒力因子如肺炎链球菌表面蛋白A（PspA）和胆碱结合蛋白A（CbpA）等［1-2］. PspA是最早确定的肺炎链球菌毒力因子之一，它可以与乳铁蛋白结合而使乳铁蛋白丧失功能并抑制补体活化，降低C3b在肺炎链球菌表面的沉淀从而干扰补体介导的调理吞噬作用，在肺炎链球菌引起的侵袭性感染中起着重要作用［3-4］. 我们用基因重组技术表达纯化肺炎链球菌毒力因子蛋白PspA，并探讨其刺激产生的抗体对肺炎链球菌侵袭性感染的抵抗作用.

1材料和方法

1.1材料血清4型肺炎链球菌TIGR4购自美国国家菌种保藏中心（ATCC）. 大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)，质粒PET?32(a)为本室保存. 质粒PMD18?T载体、限制性内切酶EcoR I，Kpn I，PrimeStar DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Takara（大连）公司. DNA提取试剂盒为上海华舜公司产品. IPTG，DAB，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)购于Sigma公司. His Tag McAb，His Bind Column(Ni?NTA)柱及HRP标记羊抗鼠IgG为Novagen公司产品. Balb/c小鼠，雌性，6~8周龄，质量18~20 g，购于重庆医科大学实验动物中心.

1.2方法

1.2.1PET?PspA表达载体的构建将肺炎链球菌TIGR4在C+Y培养基中增菌到对数生长中后期，提取基因组DNA，以之为模板扩增Psp段(1329 bp). 上游引物：5′?GGGGTACCATGATTTTAACAAGTC TAGCCAG?3′，含Kpn I位点；下游引物：5′?CGGAATTCTTATTCTTCTTCATCTCCATC?3′，含EcoR I位点，由上海生工生物技术公司合成. 胶回收PCR产物并与PMD?18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，蓝白筛选，PCR、酶切及测序鉴定. 将测序正确的克隆载体和PET?32(a)表达载体分别用EcoR I，Kpn I双酶切，胶回收目的片段，T4 DNA连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，双酶切及PCR鉴定. 重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3)，于氨苄青霉素平板上筛选.

1.2.2PET?PspA重组载体的诱导表达将阳性克隆过夜培养，按1∶20接种至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，250 r/min振摇培养，A600 nm=0.6~1.0时加IPTG（终浓度为1 mmol/L）诱导，37℃振摇1~4 h，离心收集诱导菌，SDS?PAGE分析目的蛋白表达情况.

1.2.3表达产物的纯化及鉴定低温离心收获诱导菌，冰上超声破菌，12 000 g低温离心1 h，收集上清液，同时以相同体积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，行SDS?PAGE以明确蛋白是在上清液还是在包涵体. 将上清液用0.45 μm滤膜过滤后转入镍层析柱内，用含不同浓度咪唑的缓冲液梯度洗脱，测定各洗脱管的A280 nm，SDS?PAGE监测各阶段目的蛋白情况. 收集洗脱蛋白并以PBS透析除盐，Bradford法蛋白定量，冷冻真空干燥，-20℃保存.

取诱导的全菌裂解物，经SDS?PAGE后用电转仪转膜，以His Tag McAb（1∶1000稀释）为一抗，羊抗鼠HRP?IgG（1∶3000稀释）为二抗，DAB为显色底物做Western Blot检测.

1.2.4免疫动物将小鼠随机分为2组，每组12只. 腹腔免疫小鼠，实验组方案为：①基础免疫：PspA 10 μg／只+CFA，②加强免疫：每隔2 wk加强1次(PspA 10 μg／只+IFA)，连续加强2次；对照组只注射佐剂，免疫方案同实验组. 第3次免疫1 wk后眼眶取血行ELISA检测免疫效果，用重组的PspA融合蛋白包被酶标板，加小鼠血清，再加入羊抗鼠HRP?IgG，显色后读取各孔A450 nm，以高于阴性对照组2.1倍为阳性.

1.2.5免疫保护实验①主动：肺炎链球菌TIGR4在C+Y培养基中增菌到对数生长中后期(A620 nm=0.5)，于第3次免疫2 wk后腹腔注射感染上述实验组和对照组小鼠（2×106 cfu/只），连续监测21 d，记录小鼠的生存时间. ②被动：含PspA抗体小鼠血清100 μL腹腔注射小鼠，对照组注射无菌PBS，被动免疫24 h后，每只老鼠腹腔注射2×106 cfu的TIGR4，连续监测21 d，记录小鼠的生存时间.

2结果

2.1表达载体的构建PCR产物经电泳后在1300 bp附近出现清晰的扩增条带. 扩增产物克隆于PMD?18T载体，质粒抽提后，PCR结果显示有目的基因插入，双酶切出现期望目的条带（图1），测序结果也与GenBank公布的序列一致，证明PspA编码序列正确克隆入PET?32(a)载体.

图1重组表达载体的双酶切鉴定　略

2.2融合蛋白的诱导表达与纯化转化菌诱导后与未诱导菌相比有一条明显增粗的蛋白条带（图2），其Mr 70 000左右，与期望值相符合（PspA蛋白约为Mr 50 000，再加上Mr为20 000左右的硫氧还原蛋白）. 该目的蛋白主要以上清形式存在. 镍离子柱亲和层析后，透析除去咪唑，SDS?PAGE证明纯化产物为单一蛋白，目的蛋白已达到相当纯度，凝胶扫描显示纯度达90%（图3）.

图2－图3　略

2.3表达产物的鉴定诱导的全菌裂解物经Western Blot检测， 于Mr 70 000左右处出现一条深棕色带（一抗His Tag McAb， 图4）， 表明目的蛋白带有组氨酸接头. 确证获得了带有6个组氨酸接头的融合蛋白.

图4全菌裂解物Western Blot分析　略

2.4重组蛋白免疫小鼠后血清对PspA蛋白的识别ELISA结果显示，与对照组相比，实验组小鼠产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，滴度可达1∶8000.

2.5免疫保护用致死量TIGR4攻击后，对照组小鼠在3 d之内全部死亡，生存时间中位数约为1.5 d；而注射过重组蛋白PspA的实验组小鼠在2~5 d每日有1~2只死亡，有3只存活至实验结束，生存时间中位数约为4 d. 用含PspA抗体的小鼠血清被动免疫小鼠后，用致死量的TIGR4感染，对照组小鼠在3 d之内全部死亡，生存时间中位数约为1d；而注射了含PspA抗体的实验组小鼠在2~5 d每日有1~3只死亡，有5只存活至实验结束，生存时间中位数约为4 d. 上述结果经Mann?Whitey U检验分析，两组间具有显著性差异（P<0.001）.

3讨论

PspA是肺炎链球菌重要的毒力因子，在所有临床分离的肺炎链球菌中均发现其存在［5］. 作为一种细胞壁相关的表面蛋白，它被认为是下一代肺炎链球菌疫苗中的一种很有希望的组成部分［6］. PspA主要由五个域组成：从N端到C端依次分为信号肽、a螺旋区、组氨酸富集区、胆碱结合区和C端尾巴. 其中a螺旋区是暴露在肺炎链球菌表面起着重要毒力作用的功能区，用重组PspA的肽段主动免疫小鼠发现其氨基末端的a螺旋区是其抗原表位所在点，也是抗体的作用靶点［7-8］. 我们依据TIGR4全基因组序列上的PspA设计引物，扩增了从19位到1347位共1329个碱基序列，其编码433个氨基酸. 这一序列包含了PspA a螺旋区和组氨酸富集区等最重要的功能区和抗原表位，采用PET?32（a）原核表达载体，我们实现了这一区域的高效原核表达， 经过镍离子亲和层析， 透析除咪唑后， 得到了纯度达到90%的重组蛋白， 为下一步的动物保护实验提供了坚实的物质基础.

主动免疫保护实验中，我们用致死量的肺炎链球菌TIGR4攻击重组蛋白免疫后的Balb/c小鼠，实验组小鼠的半数生存时间明显高于对照组，证明了我们所表达的重组蛋白能够诱发保护作用抵抗肺炎链球菌的侵袭性感染. 为了进一步探讨所产生的保护作用是否为抗体所介导的，我们用免疫小鼠得到的含PspA抗体的血清注射小鼠后，再用肺炎链球菌TIGR4攻击，实验组的半数生存时间同样明显高于对照组小鼠，表明了PspA抗体能够介导抵抗肺炎链球菌的侵袭性感染. 我们的实验表明了PspA能够诱发保护性抗体，从而抵抗肺炎链球菌的侵袭性感染，其保护作用可能是由于抗体补体所介导的吞噬调理作用所引起的，又或者是由于抗体与细菌表面的PspA结合后，阻断了该蛋白的一些作用，而该作用是肺炎链球菌在体内生存所必须的［9］，其保护作用机制尚需要进一步的研究.

蛋白质疫苗是肺炎链球菌疫苗的发展方向，PspA是肺炎链球菌表面最为重要的蛋白质之一，在肺炎链球菌侵袭性感染中起着重要的作用. 我们的实验结果肯定了其作为侯选蛋白疫苗的价值，下一步目标是进一步研究PspA与其他肺炎链球菌毒力因子混合免疫小鼠来抵抗其他型的肺炎链球菌感染，为自主开发多肽联合疫苗奠定基础.

【参考文献】

［1］ Yother J, Johanna MW. Novel surface attachment mechanism of the streptococcus pneumoniae protein PspA［J］. Infect Immun, 1994, 176(10):2976-2985.

［2］ Hava DL, Camilli A. Large?scale identification of serotype 4 streptococcus pneumonaie virulence factors［J］. Mol Microbiol, 2002, 45(5):1389-1405.

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［4］ Hava DL, LeMieux J, Camilli A. From nose to lung: the regulation behind streptococcus pneumoniae virulence factors ［J］. Mol Micro, 2003, 50(4): 1103-1110.

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［6］ Baril L, Dietemann J, Essevaz?Roulet M, et al. Pneumococcal surface protein A (PspA) is effective at eliciting T cell?mediated responses during invasive pneumococcal disease in adults［J］. Clin Exp Immunol, 2006, 145(2):277-286.

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［8］ Bosarge JR, Watt JM, McDaniel DO, et al. Genetic immunization with the region encoding the a?helical domain of PspA elicits protective immunity against streptococcus pneumonaie ［J］. Infect Immun, 2001, 69(9):5456-5463.

［9］ Bogaert D, De Groot R, Hermans PW. Streptococcus pneumoniae colonization: The key to pneumococcal disease ［J］. Lancet Infect Dis, 2004, 4(3):144-154.