氟对人胚肝细胞P53表达的影响

摘要： ［目的］ 探讨氟对人胚肝细胞（L-02细胞）P53表达的影响。 ［方法］ 对体外培养的人胚肝细胞染毒氟化钠40、80、160 μg/ml 24 h后，分别采用MTT试验、蛋白印迹技术（Western blot）和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测人胚肝细胞存活率、P53蛋白和mRNA水平。 ［结果］ 高浓度氟组细胞存活率显著低于对照组（P

关键词：氟；人胚肝细胞；P53基因；基因表达

文章编号:1006-3617(2007)01-0058-04

中图分类号:R114

文献标识码:A

大量研究结果表明，过量氟可导致机体多种细胞发生凋亡［1～3］。对于神经细胞来说，细胞凋亡已成为氟毒作用的重要机制之一。虽然氟是否具有致癌作用还存在争议，但一些动物实验结果显示过量氟可导致多种肿瘤的发生［3，4］，这一结论也得到部分流行病学调查结果的支持［5］。P53蛋白是抑癌基因P53的表达产物，对细胞凋亡和肿瘤细胞的增殖、分化具有重要的调节作用，是关键性调控分子之一［6］，而且目前也未见有关氟对P53影响的报道，因此本研究拟用不同浓度的氟化钠对体外培养的人胚肝细胞（L-02细胞）进行染毒，观察过量氟对P53蛋白和P53mRNA水平的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

L-02细胞：购自武汉大学中国典型培养物保存中心；氟化钠由上海试剂二厂提供；二氨基联苯胺（DAB）和双叉丙烯酰胺购自Sigma公司；丙烯酰胺和蛋白质Marker由Promage公司提供；P53鼠抗人单克隆抗体由Oncogene公司提供；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG由华美生物工程公司提供；Trizol由MRC公司提供；焦碳酸二乙酯（DEPC）由Fluka公司提供；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、dNTP Mix及Taq酶由Fermentas公司提供；垂直电泳槽和PAC300型电泳仪为BIO-RAD公司产品；UV-2401PC型紫外检测仪为日本岛津公司产品；PCR仪为Biometra TGRADIENT公司产品；水平电桥式泳槽为北京六一仪器厂产品；HVE50凝胶成像系统是美国VILBER LOURMAT公司产品。

1.2 L-02细胞的培养与处理

经复苏后的L-02细胞株在37 ℃、5%CO2条件下培养，当每培养瓶的细胞数达到（2.5～3.0）×106个时，用PBS洗涤2次后进行染毒。实验分4组，每组使用10个培养瓶。先向每个培养瓶中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液9.6 ml，低浓度氟组加0.1 ml浓度为4 mg/ml的NaF和0.3 ml PBS，中浓度氟组加0.2 ml浓度为4 mg/ml的NaF和0.2 ml PBS，高浓度氟组加0.4 ml浓度为4 mg/ml的NaF，使低、中、高3个浓度组中受试物NaF的终浓度分别为40、80和160 μg/ml。对照组加0.4 ml PBS代替受试物。整个实验重复3次。

不同处理的L-02细胞经24 h培养后，每组各取5瓶细胞用0.25%胰蛋白酶消化3～4 min并制成单细胞悬液；800 r/min离心3 min，离心机半径8 cm。后用PBS重悬，沉积的细胞用细胞裂解液［10 mmol/L Na2-EDTA，0.1 mol/L NaCl，10 μl 1 mg/ml 苯甲基磺酰氟（PMSF），10 mmol/L Tris，10 μl 1 μg/ml 抑肽酶］裂解后，用Bio-Red DC Protein Assay Kit进行蛋白质定量，调节总蛋白浓度一致，加入等量的2×SDS加样缓冲液后，于98 ℃变性10 min，室温冷却后-20 ℃保存备用。剩余的细胞弃去培养液后，每瓶加约1.0 ml的Trizol，充分混匀后移入无RNase的EP管，冰上放置5 min后加入0.2 ml的氯仿，剧烈振荡15 s，冰上静置2～3 min后，2～8 ℃、12 000 g离心15 min。小心将上层水相移至另一干净的EP管，加入0.5 ml异丙醇，-20 ℃静置2 h。2～8 ℃、12 000 g离心10 min后可见RNA沉淀物。去上清后加入1.0 ml 75%乙醇，振荡器上混匀。再在2～8 ℃、7 500 g离心5 min后弃上清，冰上静置10 min，让乙醇挥发干净。根据RNA量，加入适量DEPC水（约10～20 μl）溶解沉淀。取少量RNA溶液稀释后用紫外分光光度计测定D260和D280的值，其D260/D280在1.8～2.0之间为合格。余下的RNA溶液于-70 ℃保存备用。

1.3 MTT试验

为了检测不同浓度NaF对培养细胞存活的影响，将一长满培养瓶的培养细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，再将细胞接种于96孔培养板中培养20 h。按上述NaF染毒的方法分为4组，每组5个孔。同时另取无细胞的5个孔，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培养液200 μl作为空白对照。经24 h培养后，每孔加入20 μl 5 mg/ml 的MTT溶液，继续培养4 h后终止培养。每孔加入150 μl DMSO后振荡10 min，在490 nm波长的条件下，用酶标仪测定各孔光密度值，然后根据公式计算：细胞存活率=（D测-D空白）/（D对照-D空白）×100%。

1.4 P53蛋白的测定

根据SAMBROOK等［7］报道的方法并稍加改进，采用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离待测样品蛋白质，然后将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶封闭后加入P53鼠抗人单克隆抗体，37 ℃温育2 h后用PBS漂洗硝酸纤维素膜3次，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，在37 ℃温育1 h后再用PBS漂洗膜3次，然后加入生色底物DAB，显色后对蛋白条带进行扫描，用Gel-Pro Analyer（Version 3.0）软件对扫描结果进行分析。

1.5 P53mRNA表达量的测定

根据HSIEH等［8］的报道引物，P53：上游5′-CTG AGG TTG GCT CTG ACT GTA CCA CCA TCC-3′，下游5′-CTC ATT CAG CTC TCG GAA CAT CTC GAA GCG-3′，扩增片段为371 bp；β-actin：上游5′-GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG-3′，下游5′-GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG-3′，扩增片段为237 bp。用灭菌水将合成的引物配制成浓度为20 pmol/μl的溶液。根据第一链cDNA的合成试剂盒使用说明合成cDNA后，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）：向已灭菌的Eppendorf管中加入5 μl 10×Buffer、3 μl 25 mmol/L MgCl2、5 μl 2 mmol/L dNTP Mix、2 μl 1 U/μl Taq酶、20 pmol/μl P53上、下游引物各1 μl，各样品管加1 μl cDNA（阴性对照管以灭菌水代替cDNA），上述各管均补灭菌水至50 μl，混匀后短暂离心加矿物油。94 ℃变性 5 min后，94 ℃变性 45 s、60 ℃退火（β-actin退火温度为52 ℃）45 s、72 ℃延伸 2 min，35个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

将扩增产物与2×加样缓冲液按1:1混匀后上样于2%琼脂糖凝胶上，60 V电泳40 min后于凝胶成像系统中扫描成像，用Biocapt MV软件测每条带的积分光密度值。

1.6 统计学处理

所有实验数据均用x±s表示，结果应用SPSS 11.0进行ANOVA分析。

2 结果

2.1 氟对L-02细胞P53蛋白表达的影响

图1和表1结果显示：中、高剂量氟组L-02细胞P53蛋白表达量均显著高于对照组（P0.05），但存在上升的趋势（经直线相关分析，r=-0.921，P

2.2 氟对L-02细胞存活率的影响

由表1结果可知，高剂量氟组培养细胞存活率显著低于对照组（P0.05），但存在下降的趋势（经直线相关分析，r=0.974，P

2.3 氟对L-02细胞P53mRNA表达的影响

图2和表1结果显示：各染氟组P53mRNA表达量均显著高于对照组（P

3 讨论

1979年LINZER等在DNA病毒SV40转染的哺乳动物细胞中发现了一种与SV40大T抗原结合的蛋白，因其分子量为53 kd而命名为P53。正常机体表达的是野生型P53（wtP53），对细胞生长具有负面调节作用；当机体组织细胞受到外来刺激时，可发生基因突变而变成突变型P53（mtP53），其功能与wtP53相反。P53可调节多种基因（如p21，c-myc，bcl-2，TGF-β，IL-2，fas和bax等）的表达，对细胞的增殖分化具有重要影响［9］；同时P53是细胞应激的关键性调控分子之一，通过转录或非转录途径对细胞危急事件信号作出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应［6］，因而一直是生物医学研究领域的热点之一。

本研究结果表明：过量氟不仅可使L-02细胞的存活率下降，引起细胞损伤，而且可导致L-02细胞P53基因在转录和翻译水平上增高，表现为P53蛋白水平随着染氟浓度的增高而增高，呈现明显的剂量-效应关系；在较低浓度的氟化钠的刺激下，P53mRNA表达量的变化趋势与P53蛋白的变化趋势相似，但当染氟浓度达到160 μg/ml时，P53mRNA水平与低浓度氟组（40 μg/ml）的水平相当，虽然与对照组有显著性差异（P

本研究中高浓度氟组出现高P53蛋白、低P53mRNA水平这一的结果，可能是由于氟化钠染毒24 h后，P53mRNA已处于恢复阶段，在时间曲线上已开始下降，并且mRNA比蛋白质的半寿期要短［19］，因而导致P53蛋白相对较高，而P53mRNA水平相对较低；也可能是过量氟导致P53基因突变，mtP53水平增高，从而使P53蛋白处于一个相对较高的水平。当然，过量氟是否导致P53基因突变，需要进一步的研究加以证实。

本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。