电针对脊髓损伤后γ-谷氨酰转移酶活性影响的实验研究

(上海中医药大学,上海200032)

摘 要 对大鼠脊髓损伤后的1周、4周、8周测定其损伤处脊髓的γ-谷氨酰转移酶活性,观察电针对损伤后脊髓星形细胞代谢的影响。结果,在1周时电针组与激素组比较疗效相近,与造模组比较,差异均有显著性意义(P

主题词 电针 脊髓损伤/针灸疗法 γ-谷氨酰转移酶/代谢 祖国医学认为脊髓损伤(SCI)属"痿证""伤筋"范畴,并以针灸治疗,目前针灸疗法越来越多被用于该病的实验与临床。本研究从实验角度入手,对标志星形细胞摄取氨基酸的脂膜结合蛋白酶γ-谷氨酰转移酶(简称γ-GT)的活性进行测定,以观察针刺对脊髓损伤后星形细胞功能的影响。

1 材料和方法1.1 材料(1)动物:雌性Wister大鼠,体重160～200g,8～10周,实验结束时180～230g。由上海中医药大学实验动物中心提供。

(2)脊髓损伤模型制备[1,2]大鼠称重后,以2%戊巴比妥钠溶液(35mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于手术台上,背部剪毛消毒,切开皮肤,剥离肌肉,咬除椎板,将脊髓暴露完全,将自制的ALLEN锤(50g/cm)对准胸12脊髓,稳定脊柱,将锤落下,迅速移走ALLEN锤,消毒后缝合。

在ALLEN锤落下后,动物下肢骤然伸直,尾巴摇摆后下肢自然屈曲。

(3)主要试剂和仪器γ-GT(上海北海试剂公司生产),0.85%NaCl(无菌),匀浆器,离心管,高速低温离心机,全自动生物素测定仪(美国产BECBMANCX-4型)。

1.2 方法(1)动物分组及处理将成功造模后的60只动物随机分为3组:电针组、激素组、造模组。电针组于造模6小时后于非固定状态下开始针刺,每日针刺1次,每次15min,6天为1个疗程共治疗8个疗程。激素组于造模后5min开始皮下给予地塞米松(5mg/kg)[3],以后依次为6小时、18小时、24小时后给药,共4次,给药期间同时给予腹腔注射庆大霉素(0.6万U/100g)。造模组:造模后放于笼中正常饲养观察,不作任何治疗。各组在2周内均予以协助排尿。

(2)针刺处方及刺激参数穴位:第一组,督脉上的"大椎"和"命门"穴;第二组,胸12上下的"夹脊"穴,二组交替使用。

参数:电针频率2Hz,电流6mA,波形疏波。分别加上阴阳极,以针刺处的背部肌肉轻微跳动为度。

1.3 检测项目[4](1)制备脊髓匀浆液心脏穿刺致死大鼠,切取以胸12为中心上下共长1cm去脊髓外膜,每0.3g脊髓重量加1ml的生理盐水,冰浴中匀浆后离心(4℃,3000r/min),15min,吸取上清液至无菌瓶中待测。

(2)测试将全自动生物素测定仪调节稳定后放入样本进行测定。

1.4 统计学方法:t检验。2 结果见表1。

第1周:电针组与激素组比较,差异无显著意义,但二组与造模组比较差异均有显著意义(P

第4周:电针组与激素组及造模组比较,差异均有显著性意义(P

第8周:差异情况与第4周时相同,但与正常组比较激素组与造模组的γ-GT活性仍呈降低态势,电针组的γ-GT活性也较第1周及第4周为低。

3 讨论3.1 类固醇激素的治疗及存在的问题关于类固醇治疗SCI的依据均源自动物实验。Ducker等首先报道了用类固醇激素治疗动物脊髓损伤:给狗造成315g/cm损伤,3小时后肌注地塞米松1周,12只狗中有4只功能恢复接近正常[5]。日前该药已由动物实验过渡到了临床应用,对其研究认为该药可提高神经的兴奋性与传导[6],改善脊髓的血流量[7,8],减少脂质过氧化,除此之外还可促进分泌NGF生长因子[9,10]。目前,在治疗脊髓损伤中美国在1985年急性脊髓损伤研究中肯定了类固醇激素的作用,然而对于它的应用也还存有一些问题:1)用药时间必须在8小时之内,对地塞米松的要求则在1小时以内,超过此时限将无效。2)大剂量使用后的副作用如感染和创伤后的应激状态会导致病人血糖增高,抵抗力降低加重感染。3)疗程有时限:尽管该药疗效显著,但不可能长期大剂量使用。因此对于SCI的治疗应采用分阶段有重点、并采用多种方法结合治疗方可取得更佳之疗效。

3.2 大鼠SCI模型的建立动物模型的成功建立是研究SCI病理及评价方法是否有价值的基本要求。至今,仅机械损伤模型就包括很多如(1)脊髓挫伤(重物坠落致伤和压迫致伤),(2)脊髓震荡,(3)脊髓牵拉,(4)脊髓切割。造模方式众多,但选择的标准是接近临床损伤症状为最佳。

本研究选择了重物坠落致伤模型(WD法),该法以克厘米为定量单位使物体垂直下落,造成不同程度的脊髓损伤,该法简单易行,其打击的量可以控制和计算,创伤的位置可以通过手术限定,故定量标准,控制性能好,不撕破脊髓硬脊膜,重物也不切割脊髓,可以防止结缔组织或其它外来成分侵入损伤处从而影响研究结果。我们在原造模的基础上进行了一些改良:如固定动物,造拱形手术台,稳定脊柱,使在打击的瞬间快速而准确。目前对WD法的研究表明该法致伤模型与人类脊髓损伤的相关性最好,它所产生的缺血、缺氧等一系列继发损伤与临床所见的损伤基本相符[10～12],因此该法在SCI的实验研究方面得到了较多的运用。

由于本实验在造模后2周内协助大鼠排尿,因此一定程度上降低了各组动物的死亡率,特别是对造模组大鼠,往往协助它们排尿的时间相对较长。

3.3 γ-GT的生理功能γ-GT,是一种分布广泛的质膜结合糖蛋白,它能催化γ-L-谷氨酰氨基团的转移,完成γ-谷氨酰基循环,在细胞摄取氨基酸的过程中发挥作用;由于它是体内唯一能够转移谷胱苷肽(GSH)及其衍生物中γ-谷氨酰基的酶,因此它参与GSH的合成及分解代谢;另外还有解毒的功能。在胚胎时期中枢内的γ-GT活性较高,说明它与神经系统的生长代谢关系密切[13],并有人据此测定脑损伤后的γ-GT的活性,认为它与星形胶质细胞的功能活跃及增殖有关[4]。3.4 星形细胞与γ-GT体内及体外的实验证明:中枢星形胶质细胞具有摄取和释放谷氨酸(GLU)的能力,是GLU代谢的关键部位,星形胶质细胞摄取氨基酸的目的主要是防止过量的GLU释放到周围的神经元以免引起神经元的过度兴奋[14]。事实上,损伤后脊髓组织兴奋性氨基酸的增加,在触发SCI后病理改变中起着重要作用,而这种SCI后的兴奋性氨基酸的增加可能与突触的释放增加,细胞摄取的减少以及血脑屏障受损导致的血浆游离氨基酸移动入神经外间隙等原因有关[15,16]。因此作为血液神经元屏障及脑脊液神经元之间的屏障,一旦星形细胞功能损失,无疑会给神经元的恢复及生长代谢带来很大的影响。

3.5 电针对γ-GT活性影响的意义我们曾对电针后脊髓损伤大鼠的行为活动进行过观察,发现在1～2周内尿便恢复不良的大鼠,则肢体功能恢复不佳甚至死亡,这与由此引发的感染有关。二种治疗手段对于损伤的各阶段均有作用,而电针对于后期的康复仍有积极的意义。

我们在实验中发现电针治疗后各阶段均有明显的γ-GT升高,这对于神经元修复保护有着积极的影响,即使在后期的治疗,针刺后损伤段的γ-GT仍有增高,因此认为针刺对后期的治疗仍有一定的意义。推测这可能与早期细胞功能减退神经组织水肿,后期出现较大坏死区域,空洞及瘢痕的形成有一定的关系。

有人研究认为γ-GT的活性升高是与细胞分化和成熟有关[17],在此我们也认同此观点,针刺提高了γ-GT的活性并非一定是刺激了星形细胞的增殖结果,而可能是以提高了星形细胞的某些功能为主。

曾有研究用免疫组化及电镜等方法对存活2小时～54年脊髓受损伤后的尸检材料,发现即使在创伤4～5个月以后,损伤的脊髓内部也出现许多轴突再生巢,巢内的雪旺氏细胞表达了神经生长因子受体,因此支持并引导中枢轴突的再生,所以后期形成的胶质瘢痕并非绝对不可逾越[18]。对γ-GT的研究表明,除早期的积极治疗外,后期适当的药物及其它方法的治疗也很有必要,而针刺不失为康复期的一种值得选用的方法。

4 参考文献

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16 刘连生,等.脊髓损伤及继发性损伤时的兴奋性氨基酸含量的变化.中华神经外科杂志,1994;10(2):70

17 唐玲光,等.植物血凝素在小鼠骨髓细胞染色体畸变分析中的作用.哈尔滨医科大学学报,1981;2:19

18 王子慧,等.脊髓创伤后施万氏细胞神经生长因子受体的表达及在轴突再生中的作用.中华神经科杂志,1996;29(4):237(收稿日期:1999-09-20,齐淑兰发稿)