HPLC―DAD测定润肠丸(浓缩丸)中大黄酸成分

摘要：目的 建立润肠丸中大黄酸成分的高效液相色谱测定方法。方法：Phenomenex Luna C18柱（5um，150x4.60mm，100A）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（60：40）；流速：1.0mL・min-1；二极管阵列检测器，检测波长：254nm；柱温：40℃。结果：该方法测定润肠丸中大黄酸成分时，线性关系良好，r2=1.000，平均回收率（n=6）为99.35%。结论：方法简便，快速准确，可作为样品的检测方法。

关键词：润肠丸（浓缩丸）；大黄酸；高效液相色谱法

Determination of the Rhein in Runchang Pills （Concentrated pill） by HPLC-DAD

ZHU Ren-yuan1，PU Yu-hong2

（1.Lanzhou Institute for Food and Drug Control，Lanzhou 730000，Gansu，China；2.Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730000，Gansu，China）

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the determination of the contents of rhein in Runchang pills.Methods The separation was performed on Phenomenex Luna C18 column（5um，150x4.60mm，100A）with a mobile phase of acetonitrile-1% Phosphoric acid（60：40），and the flow rate were 1.0mL・min-1.Photodiode Array detector was used and the wavelength of detector for rhein was set at 254nm，and 40℃ for column.Results The method for determining runchang pill in rhein composition， linear relationship is good， r2 = 1.000， and the average recovery （n = 6） was 99.35%.Conclusion The method is accurate and sensitive.

Key words：Punchang pills （Concentrated pill）；Rhein；HPLC

当今，中成药在欧美发达国家愈加普及，特别是一些合成药品频现严重不良反应，使得公众愈加倾向于接受中成药，传统医药产业发展迅速且前景看好。与此同时，传统药品由于缺乏管理而产生的安全隐患也越来越引起政府有关部门和立法机关的重视，欧盟各国政府和立法部门开始加强对此类产品的管理和立法，对产品质量和安全性的要求将越来越高，中成药在欧洲以食品或食品补充剂销售的前景将面临越来越多的限制。中成药需要找到符合其本身特点和规律的立足点，即中成药既要以治疗药物的身份进入欧洲市场，同时也要继续寻求扩大作为食品补充剂的渠道。润肠丸（浓缩丸）是我国卫生部药品标准中药成方制剂，由大黄、当归、桃仁、羌活及火麻仁5味中药制成浓缩丸，主要有肠壁、软化干结大便、增强肠管蠕动、抗菌、解热等作用，用于治疗实热便秘。其中大黄具有导滞通便、泻火解毒等作用。其化学成分主要含蒽醌衍生物，如大黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚，大部分为结合状态。为了比较全面地控制润肠丸的质量，我们以该制剂中大黄含有的大黄酸作为指标成分，用HPLC法建立其含量测定方法。

1 仪器与试药

日本岛津LC-20AB高效液相色谱仪系列：在线脱气机，二元泵，二极管阵列检测器，自动进样器，柱温箱，色谱工作站；梅特勒XS-205电子分析天平，十万分之一；成都康宇RE-2000旋转蒸发仪；对照品：大黄酸对照品（0757-200206），供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所；润肠丸（浓缩丸）（批号：12D1A、2012028-2、2012092、12E2A、2012078-3、2012098-4，规格：每8丸相当于原生药3g），由兰州佛慈制药股份有限公司生产；超纯水制备仪，成都超纯科技有限公司，型号UPH-I-10T；甲醇、磷酸均为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2溶液的制备

2.1 对照品溶液 精密称取大黄酸对照品10.68mg，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液 精密称取润肠丸（浓缩丸）粉末2g，加入甲醇25mL，称定重量，超声处理1小时，放冷。再称定重量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5mL，挥去溶剂，加2.5mol・L-1盐酸溶液10mL，超声处理5min，再加入氯仿10mL，超声处理1h，放冷，置分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿萃取4次，20mL/次，合并氯仿液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液进行HPLC测定。

3 实验方法

3.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18柱（5um，150x4.60mm，100A，广州菲罗门公司生产）；流动相：甲醇-0.1%磷酸=75：25；流速：1.0mL・min-1；进样：10uL；检测波长：254nm；柱温：40℃。

图1 大黄酸对照品与润肠丸（浓缩丸）样品的色谱吸收图谱

3.2 线性关系考察 分别精密吸取大黄酸对照品溶液1mL、5 mL、10mL、15 mL和20 mL置25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，进样10uL，测定其峰面积，以进样量（ug）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，其回归方程为：Y = 10190954.34X - 100859.21 ，r=0.9999。线性范围为：0.03～1.28ug。

表1 线性关系测定数据

进样量（ug） 0.04272 0.2136 0.4272 0.6408 0.8544

峰面积 337190 2078447 4203588 6431578 8608137

3.3 最低检测限 在选定的色谱条件下，当信噪比S/N=3时，对大黄酸最低检测限进行测定，结果表明，大黄酸的最低检测限为1.068ug・mL-1。

3.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液10uL，连续进样6次，测定峰面积，计算精密度。结果大黄酸的RSD（n=6）为0.52%。

表2 精密度试验检测数据

序号 1 2 3 4 5 6

峰面积 4203588 4240971 4245886 4239507 4254324 4203892

3.5 稳定性试验 精密吸取对照品溶液，分别于0h、6 h、12 h、24 h、36h与48 h时进样，每次10uL，测定峰面积，计算精密度。结果大黄酸的RSD（n=6）为0.57%。

表3 稳定性试验检测数据

序号 1 2 3 4 5 6

峰面积 4186294 4235077 4233106 4222376 4207839 4177783

3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的6份润肠丸（浓缩丸）样品（批号：12D1A，大黄酸含量0.98mg/g）各0.5g，按"2.2"项制备，分别精密加入一定量的大黄酸对照品溶液，按"3.1"项下色谱条件进样10uL，测定大黄酸含量，计算回收率，结果平均回收率为（x±s，n=6）为99.35%±0.57%。

表4 加样回收率试验检测数据

3.7 样品测定 按照本文方法，对6批润肠丸进行测定，用回归方程法计算含量，每批平行测定2份，结果见表5。

表5 样品含量测定结果（mg・g-1，n=2）

批号 12D1A 2012028-2 2012092 12E2A 2012078-3 2012098-4

大黄酸 0.98 0.70 1.19 0.68 0.76 1.49

大黄酸对照品的UV光谱 润肠丸样品的UV光谱

图2 UV光谱对比，相似度达到0.998。

3.8 空白试验 按照"2.2"项下方法制备阴性制剂，按"3.1"方法分析，阴性样品色谱在大黄酸相应保留时间位置无干扰峰。

4 结果与讨论

4.1 检验方法选择 润肠丸（浓缩丸）由大黄、当归、桃仁、羌活及火麻仁等五味组成。曾设想用薄层色谱法进行检查，但由于处方复杂，干扰成分多，未能有效分离。采用高效液相色谱法，大黄酸检验灵敏度高，可实现有效检测。

4.2 色谱条件优化 对照品溶液在190-600nm范围内进行全波长扫描，结果表明：大黄酸在255+2nm处有最大吸收，通过实验，确定254nm为检测波长。考察了不同比列、类型的流动相组成，确定在"3.1"项下的色谱条件下，大黄酸保留时间为4.561min，样品中大黄酸的色谱峰与其他峰的分离度大于2.0。

4.3 考察了不同提取溶剂、不同超声时间和方法的影响，实验结果表明，在酸性条件下，超声处理后用氯仿萃取，可获得较高的提取效率。

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