TRAIL诱使肿瘤细胞死亡的机理

引 言

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体( tumor necrosis factor related apoptosis-inducingligand，TRAIL) 是 1995 年发现的一个肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor，TNF) 家族成员[1]。它能特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性，因此具有被开发成治疗肿瘤的蛋白质药物的可能性[2~4]。正是由于这一神奇的特性，引发了人们对其作用机理研究的浓厚兴趣与热情。到目前为止，已经有 5 个 TRAIL 受体被鉴定出来[5~9](FasL、TNF-α等一般只有1~2受体)，这表明了 TRAIL 蛋白在细胞中发挥功能的复杂性。本文以 TRAIL 及其受体为出发点，阐述 TRAIL 特异性诱导肿瘤细胞凋亡的机理及其在肿瘤治疗方面的应用前景。

TRAI L及其受体的发现

TNF家族中许多成员在细胞凋亡中发挥着重要作用，其中，配体包括 FasL、TNF、LTa、Apo3L 等，受体包括 Fas、TNF-R1、TNF-R2、Apo3 等，配体通过受体把死亡信号传入细胞内，导致细胞凋亡[10]。TRAIL 是 1995 年才被发现的 TNF 家族新成员，与其它配体比较，不同之处在于：1) TRAIL 具有强大和特异性诱导肿瘤细胞凋亡的能力，但对正常细胞无此效应；2) 比 TNF-α 和 Fas-L 有更广的抗癌谱；3) 对 NF-κB 仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L 那样产生严重的炎症反应。因此，TRAIL 被认为是一种更为安全且极具潜力的抗肿瘤因子[11]。TRAIL广泛地表达于脾、淋巴结、肺、肾、卵巢和前列腺等大多数正常组织，在肝、脑组织及中未发现表达。TRAIL 可特异性地诱导转化细胞、病毒感染细胞和肿瘤细胞发生凋亡，而对正常细胞基本没有影响。此外，在激活的 T 细胞、自然杀伤细胞、单核细胞及树突状细胞中也发现了 TRAIL 的表达，这说明 TRAIL 与宿主防御和维持免疫稳态相关，参与机体免疫调节[12]。与 TNF 超家族其它成员一样，TRAIL 以同源三聚体作为活性单位，与细胞表面特异性受体结合而发挥功能。TRAIL结合的受体主要分为三类：1) 死亡受体 (death receptor，DR)，均含死亡结构域并能向细胞内传递死亡信号，当 TRAIL 与 DR 结合时，能够触发TRAIL诱导细胞凋亡；2) 诱骗受体 (decoy receptor，DcR)，胞外区均有 2 个与 DR4、DR5高度同源的富含半胱氨酸的重复序列，但缺失或者部分缺失死亡结构域，能与TRAIL 结合但不能传导凋亡信号，当TRAIL 与 DcR 结合时，可以逃逸 TRAIL 诱导的凋亡，抑制细胞凋亡途径[13]；3) OPG (又名 TNFRSF11B)，是一种分泌性蛋白质，主要作用是减少破骨细胞的数量，增加骨密度，促进骨质沉积，又是一种RANK 的水溶低亲和力抑制剂[14]。目前为止，人的5 个 TRAIL 特异性受体已经被鉴定出来：死亡受体 TRAILR1 (又名 DR4)、死亡受体TRAILR2 (又名DR5)、诱骗受体TRAILR3 (又名DcR1)、诱骗受体TRAILR4 (又名DcR2)和 OPG (见图 1)[13]。

TRAI L及其受体复合物的三维结构

TRAIL 前体属于 II 型跨膜蛋白，全长 281 个氨基酸，相对分子量 32.5 kDa，等电点为7.63，以同源三聚体为活性单位形式存在。TRAIL 蛋白的 N 末端无信号肽，其 109 位氨基酸残基是一个N 连接糖基化位点，可被金属蛋白酶切割，产生 114～281 个氨基酸残基的胞外活性部位[15]，其中，第 230 位有一个不配对的半胱氨酸 (C230)，这是一个重要的功能基团。近氨基末端裂解点处的 137～152 位氨基酸可以形成一个由 12～16 个氨基酸残基组成的拉长的 AA 环，此环对 TRAIL 发挥其细胞毒活性及与其受体的结合起着关键作用。TRAIL在第 230 位存在 1 个不配对的 Cys 残基 (Cys230)，它能与二价锌离子螯合，从而使TRAIL形成典型的链夹心三聚体活性结构。因此，Cys230 对维持 TRAIL 的空间结构及正常的生物活性具有决定性作用[16]。TRAIL单体含有由两个反平行β片层形成的β三明治核心骨架结构，与临近单体以头尾相结合的方式组成“铃”型同源三聚体的活性单元。三聚体的一端比较宽广，称为“底部”，另一端较为狭长，称为“顶部”。β 片层 A"、A、H、C 和 F 为内部 β 片层，与临近单体的内部β片层相互作用，而β片层 B'B、C、D 和 E 为外部片层。8 个芳香族氨基酸 (125位组氨酸、163 位苯丙氨酸、183 位酪氨酸、185 位酪氨酸、189 位酪氨酸、243 位酪氨酸、274 苯丙氨酸和 278 苯丙氨酸) 定位在蛋白表面，形成一个疏水凹槽，能与相应受体发生“齿轮”式相互作用[17,18](图2)。TRAIL与死亡受体的相互作用起始于细胞凋亡信号，TRAIL 与 DR5 复合物的晶体结构揭示：3 个 DR5 受体分子结合在 TRAIL 同源三聚体的表面凹槽部位，每个受体与 TRAIL单体分子的相互作用面积高达2750 魡2，其中，受体分子贡献1400 魡2，TRAIL 单体分子贡献1350 魡2。每个作用面又由两个独立的 patch A 和 patch B 组成。Patch A (相互作用面积880 魡2)由受体分子90 s (residue91～104)和TRAIL 分子 205 位谷氨酰胺附近的区域结合部位组成；patch B (相互作用面积 750 魡2)主要由受体分子 50 s (residue51～65) 与 TRAIL 分子 216 位苏氨酸附近的区域结合部位组成。patch B 在 TNF 超家族与受体复合物中高度保守，且具有广谱的疏水特性；而patch A却拥有很好的特异性，在特异性选择受体中发挥重要功能[19](图 3)。

TRAI L分子诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制

当TRAIL 受体 TRAILR1 和 TRAILR2 与自身竞争性单克隆抗体或者 TRAIL 结合后，诱发受体在细胞膜上发生三聚化并起始细胞凋亡途径[20]。该过程的发生主要是通过死亡受体 DR4 或 DR5 与 TRAIL 结合后形成的配体 / 受体三聚复合物，诱导死亡受体胞浆段死亡结构域( death domain，DD) 与 Fas 相关蛋白的死亡结构域 (Fas-associated protein withdeath domain，FADD) C 端 DD 的结合。FADD 以其 N 端死亡效应结构域 (death effectordomain，DED) 与 procaspase-8 结合，形成 DR4/DR5/FADD/procaspase-8 死亡诱导信号复合物(death inducing signaling complex, DISC)，促使其中procaspase-8 自身催化成有活性的caspase-8。Caspase-8 活化后，通过两条信号途径传递凋亡信号。Ⅰ型细胞通过线粒体非依赖型途径，即活化的caspase-8 直接激活下游效应蛋白 caspase-3、caspase-6 或 caspase-7 而诱导凋亡[3,21]。Ⅱ型细胞通过线粒体依赖型途径传递凋亡信号，活化的 caspase-8 催化 Bcl-2家族蛋白Bid 断裂形成截短的 Bid (tBid)，tBid 定位于线粒体膜，引起线粒体跨膜电位降低或破坏，促使线粒体释放细胞色素c (Cyt c)及 Smac、Cyt c、Apaf-1 和 dATP，同时，tBid可以通过结合 BAX 和 Bcl-2 同源 BAK 来放大死亡受体诱导的凋亡信号，共同促使procaspase-9自身催化形成有活性的 caspase-9，进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡[21]。依据细胞类型的不同，Bid 的切割活化可以作为起始细胞凋亡的原始信号，也可以通过同时激活内在和外在的细胞凋亡途径来放大细胞凋亡反应[22~28](图 4)。以前普遍认为，TNF 受体超级族起始以单体形式存在，只有当与三聚体的相应配体结合后才形成受体三聚体。然而最近几年，大量的证据表明，一定的 TNF 受体可以在与相应配体结合前便以三聚体形式存在[29]。在不与配体相互作用前就发生的受体自身三聚化现象，最早在TNFR1、TNFR2 和 Fas 被证实[30,31]，介导受体单体自发形成三聚体的前配体组装结构域 PLAD 定位在受体的 CRD 结构域，DR4 和 DR5 也被报道存在 PLAD 依赖的自身聚合现象[32]。更好地理解 DR4 和 DR5 受体如何通过 PLAD 调节自身聚合，将为发明用以解决TRAIL诱导不敏感的肿瘤细胞凋亡的新方法提供方向。

以TRAI L为靶点的肿瘤生物治疗研究

现有的研究证实，TRAIL 对于大多数来自骨髓、前列腺、乳腺、肺、肾、脑和皮肤的恶性肿瘤细胞有抑制生长和细胞毒性效应，而人体的正常细胞对 TRAIL 诱导的凋亡耐受。Mitsiade等[33]用 TRAIL 诱导对类固醇及化疗敏感抵抗的骨髓瘤细胞株凋亡。Choi 等[34]研究表明，TRAIL可诱导人神经蚀质瘤细胞株(CRT2MG、U872MG)凋亡。Walczak 等[35]构建了异亮氨酸拉链-TRAIL重组体(人 Flt3L 基因在 5' 端，人 TRAIL 基因在 3' 端)，用其处理带有乳腺癌的荷瘤鼠癌组织，可使乳腺癌组织消退，并且出现肿瘤的剂量依赖性生长抑制和肿瘤的清除。

TRAIL 蛋白的重组表达

TRAIL 重 组 蛋 白 的 形 式 有 很 多 种 ， 主 要 包 括 全 长 TRAIL、 sTRAIL41-281、sTRAIL55-281、sTRAIL95-281和 sTRAIL114-281。有时，为了便于纯化或增加 TRAIL 活性三聚体的稳定性，会对重组 TRAIL 进行修饰，如添加 His、FLAG 和 GST 标签，或在构建重组TRAIL时添加亮氨酸拉链等。但在随后的毒性实验中发现，这些修饰会影响 TRAIL的空间结构，从而阻碍 TRAIL 与二价锌离子的最优结合，最终导致重组 TRAIL 对正常肝细胞的毒性。

死亡受体蛋白抗体

抗DR4和 DR5 单克隆抗体与其受体结合，同样可以诱导肿瘤细胞凋亡。美国人类基因组科学公司(HGS)研究发现，人源抗 DR4 的单克隆抗体 (Mapatumumab/HGS-ETR1) 和人源抗 DR5 的单克隆抗体 (Lexatumumab/HGS-ETR2、HGS-TR2J) 对肾癌、膀胱癌及前列腺癌等泌尿生殖系统的癌细胞，具有明显的诱导凋亡作用。Lexatu-mumab 对体内肾癌种植模型也具有明显的抗肿瘤作用[36]。Ichikaua 等[37]应用一种新的抗人 DR5 单克隆抗体 (TRA-8)研究发现，无论在离体还是活体状态，TRA-8 均能诱导对 TRAIL 敏感的肿瘤细胞的凋亡，TRA-8 也能诱导原代肝癌细胞株的凋亡，而对正常肝细胞的损伤却不明显。

展 望

虽然 TRAIL 及其受体在十几年前就已经被鉴定出来，而且关于 TRAIL 如何发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制及其在肿瘤治疗方面的研究已经取得很大成绩，但是还有许多空白领域有待于继续探索。最近几年，重组截短的 TRAIL 和拮抗 TRAIL 受体的单克隆抗体的快速发展及其在临床试验中所展现出的振奋人心的效果，极大地推动了以TRAIL 为靶点在肿瘤治疗方面的研究。然而，不断出现的耐药性又不禁使人们怀疑它的应用价值，如何合理地联合化疗、放疗、生物治疗等措施，逆转耐药性、提高 TRAIL 杀伤肿瘤细胞的活性，是肿瘤治疗的新方向。