DNA 损伤修复阻断癌变的发展

引 言

DNA 是一个结构十分精巧的分子，极易受到细胞内外环境中物理、化学和生物因素的直接或间接伤害，产生许多 DNA 自由基性的瞬态产物[1,2]，引起 DNA 链断裂及碱基的变化或丢失，最终由瞬态损伤变成稳态损伤(永久损伤) 。在细胞和组织中能检测到DNA 瞬态[3～5]和稳态[3]两种损伤产物，而癌症患者淋巴细胞和病灶的 DNA 稳态损伤特别严重[6]。DNA损伤会导致突变、癌变、衰老和诸多重大疾病[7～9]。细胞具有修复 DNA 损伤的能力，它是维护健康的基本生命过程。反之，缺乏修复能力则可引发癌变、遗传变异和众多疾病[10,11]。因发现 DNA 双螺旋结构而获诺贝尔奖的两位得主之一 Crick 曾特别强调修复在防癌中的重要作用，他说：“我现在才认识到在讨论 DNA 突变时不能避而不谈修复”。机体中存在着两种修复机制：酶性修复和非酶性修复。前者广为人知，后者又称快速修复，知者不多。酶性修复有效、准确，但也存在明显缺点：1) 修复酶本身是蛋白质，易氧化失效；2)酶活性不稳定，会因衰老和患病而下降[12]；3)修复太缓慢，需几十分钟甚至几个小时才能完成[3,13,14]，因此只能修复DNA 的稳态损伤，不能修复寿命仅以飞秒 (10－15秒)到微秒(10－6秒)计的 DNA 瞬态损伤[15,16]，好比“急病偏遇慢郎中”。如果 DNA 瞬态损伤得不到及时修复，就有可能发展成致病甚至致命的 DNA 稳态损伤。早在 1974 年，Willson 等人[17]在Nature上首次报道了一种新的能快速修复生物大分子瞬态损伤的化学反应。10 年后陆续有报道称巯基化合物和抗坏血酸[18,19]、咖啡酸和芥子酸[20]、苯丙素甙类[21]、水飞蓟素和其它黄酮类[22,23]、儿茶酚类[24]等都能以极高的速率快速修复 DNA 瞬态损伤。尽管快速修复的意义极其重要，但由于捕获和检测瞬态损伤的难度极大，具有这种条件的研究机构即便在发达国家也是凤毛麟角，这就决定了快速修复只能是孤寂的研究领域，发表的论文屈指可数，引用率也必然不高，机制性探索几乎没有。本组从 20 世纪 80 年代后期开始深入研究快速修复的机制及其抗癌作用，得到了中国科学院上海原子核研究所(现名应用物理研究所)、巴黎第七大学和法国国家研究中心拓扑动力学研究所的协助。有关快速修复功能和机制的研究成果已在Chemical Society Reviews上进行了报道[25]，有关快速修复迫使癌逆转的研究成果也在该学会新刊RSC Advances上做了报道[26]。本文不仅将两部分融合在一起，而且更加完整、详尽和透彻。图 1 所示为快速修复 DNA 自由基阻断癌变的初始过程，此图可看作对全文的图解。

DNA瞬态损伤的快速修复

快速修复的特点

能修复多类DNA瞬态损伤

我们利用脉冲辐解技术和瞬时吸收光谱，研究多种植物多酚类对DNA 瞬态损伤的快速修复作用，发现被快速修复的 DNA 瞬态损伤共有 15 种，包括 DNA-OH•加合物[27～31]、DNA阴离子自由基[32～36]、DNA 阳离子自由基[37,38]、聚核苷酸(poly G、poly A和 poly C)，直到单链 DNA 和双链 DNA[39～42]。修复速率常数都极快，可达到 109L•mol－1•s－1。

能修复DNA各结构层级的损伤

上述的 15 种损伤分属于 DNA 的 5 种结构层级，由低到高依次为：碱基、核苷、核苷酸、聚核苷酸，直到完整的 DNA 片段，它们都可被植物多酚类快速修复。

能被多种植物多酚类修复

兰州大学有机功能分子化学国家重点实验室贾忠建研究组从甘肃生长的玄参科马先蒿属植物中分离纯化了不少多酚类化合物，我们测定了其中的 11 种，并从试剂公司购买到另两种植物多酚类(槲皮素和芦丁)，实验证明它们都有快速修复 DNA 损伤的作用。图 2 只列出其中9种植物多酚类的结构：毛蕊花甙 ( verbascoside， VER) 、 米 团 花 甙 A( leucosceptoside A，LEU A) 、马先蒿甙A ( pedicularioside A，PED A) 、角胡麻甙(martynoside，MAR)、肉苁蓉甙C (cistanoside C，CIS C)、稗甙(echinocoside，ECH)、红景天甙(salidroside，SAL)、6-O(E)-p-阿魏酰甙(6-O(E)-p-feruloyl-glucose，FGC)和6-O(E)-p- 羟基 - 肉桂酰甙 (6-O(E)-p-hydroxyl-cinnamoyl-glucose，HCG)。表 1 为其中 6 种多酚类对DNA-OH•加合物的修复速率常数。从表 1 中可以看出，含有 3～4 个酚羟基的植物多酚类的修复速率常数明显大于只有 1个酚羟基的多酚类，即酚羟基数越多则修复能力越强。除表 1 所列 6 个多酚类外，其它多酚类也呈现出相同的规律[31,36,39～42]。

化学系统和细胞中都有快速修复机制

我们首次发现细胞中也存在快速修复机制，并采用抑制细胞中修复酶活性[43]或在细胞的酶性修复尚未启动的间隙[44]对快速修复的机制进行了验证。这更加显现出快速修复的生物学和医学价值。

快速修复的化学反应

用•OH 攻击胸腺嘧啶 (T) 或去氧一磷酸鸟苷酸 (dGMP)，可分别生成 T-OH•或dGMP-OH•加合物。植物多酚类毛蕊花甙 (VER) 能将一个电子供给 T-OH•或 dGMP-OH•，而 VER 自身的酚羟基 (Ph-OH) 则变成了酚氧基 (PhO•)，从而将 DNA 碱基 -OH•加合物或核苷酸 -OH•加合物修复成了 T 和 dGMP[27～30,32～34,37]。dGMP-OH•被 VER 修复的反应式如下：这个反应式是由瞬时吸收光谱证明的，dGMP-OH•和VER-PhO•的特征峰分别为310 和360 nm。在 dGMP-OH•的特征峰渐降以至于消失的同时，VER-PhO•的特征峰却从无到有，并且在 4 μs 内升到最高点，此消彼长，这正反映了 DNA 的修复过程[27]。

快速修复只需 4 μs，比酶性修复快 10 亿倍

作为修复反应产物，VER-PhO•在 4 μs 内就达到最大值并维持在这一水平，表明修复只需4 μs，而酶性修复需时数十分钟到几个小时(例如碱基外切酶对 FAPy-Gua 和 8OHG 修复的半衰期为8～60 min)[3]。可见，非酶性修复比酶性修复快 9～10 个数量级，即快了 10 亿倍，从而可以抢在细胞分裂前完成修复，阻断 DNA 瞬态损伤向稳态损伤的过渡，也阻止了DNA损伤通过细胞分裂传到子代。

快速修复的确证

仅凭上述实验尚不能武断地把多酚类物质减少DNA瞬态损伤归功于快速修复，因为植物多酚类还能清除多种活性氧[45～51]，DNA 瞬态损伤的减少也有可能是由于活性氧被清除的结果。为此，我们进行了甄别研究[27～29]。如果系统中同时含有 DNA、活性氧 (以 OH•为例)和多酚，那么有可能发生两种反应：1) OH•有可能直接攻击 DNA，以 dGMP 为例，生成羟基加合物dGMP-OH•，导致DNA 瞬态损伤 (反应式 3)；2) OH•也可能被多酚(以VER 为例)清除掉，根本伤不到 DNA (反应式 4)。根据反应物浓度及反应速率常数k，可计算出反应式(3)的竞争系数为 0.908～0.989[30]，这意味着 dGMP 被 OH•攻击使 DNA 损伤的几率是 90.8%～98.9%，也就是说反应式(4) (即 VER清除OH•)发生的几率只有1.1%～9.2%。可见，在这个反应系统中起压倒性作用的确实是快速修复机制，而不是活性氧清除机制。

快速修复的机制是电子转移

早在 1997 年，我们就通过化学快速反应指出快速修复的机制为多酚类与损伤 DNA 间发生的电子转移[28]，但当时还没有更多的证据。当采用计算机化学技术和分子模型技术后发现，多酚类物质(以 CIS C 为例) 可向 DNA 双螺旋小沟对接 (docking)。对接后，CIS C(图1 下排黑色方块中左侧红色分子) 停靠在特定距离处，使得多酚的酚基氧原子与 DNA 碱基氮原子间形成一个不太紧密的非共价键结合，正像把一张膏药恰到好处地贴在DNA伤处，治愈后自行脱落。我们经过计算发现 O-N 间的距离恰巧为 3 魡，这一距离是电子转移的必要条件，若小于 3 魡，多酚与 DNA 将形成牢固的共价键，好比将脚镣钉在 DNA 脚上；若大于3 魡，则电子不能转移，也就无从修复。有趣的是，CIS C 停留在 3 魡 位置时的能量最低，即处于最稳状态，甚至出现负值[52～54]。从图2 中多酚类物质的结构可见，与葡萄糖相连的鼠李糖或芹糖决不是可有可无的，它们为确保多酚的羟基与DNA 碱基维持在 3 魡 的确切距离上而起着几何阻挡作用[53]，鼠李糖或芹糖像小船舷旁挂的旧轮胎，防止船体撞坏码头。生物进化是多么精确和神奇！天生我材必有用(李白语)，大自然不允许奢华(电子生物学之父、诺奖得主 Szent-Gyorgyi 语)，这是富有启迪性的科学哲学思想，同时对人工合成多酚类化合物也有提示作用。至此，我们从化学反应和计算机化学两方面确证了快速修复的电子转移机制。

快速修复的构效关系

从图 2 所示多酚类的结构可见，VER、PED A 和 CIS C 由糖基构成的主干的两侧均为多酚基团，其中长臂(左侧)含有 3 个碳并有双键，所以活动度受到限制，称为苯丙烯酰基；另一短臂(右侧)只有 2 个碳且均为单键，所以活动度大，称为苯乙基。其余三种多酚类只有一个臂，其中 SAL 只有短臂，几乎没有快速修复能力 (表 1)；而 FG 和 HCG 都是长臂，且都有修复能力(虽远弱于前述三种多酚类) (表 1)。由此推测，多酚类的长臂 (苯丙烯酰基)在修复中起主要作用，它的臂长且有刚性，容易嵌入 DNA 双螺旋小沟；如果臂短且缺乏刚性，则不易嵌入小沟[53]。图 3 多酚类物质(左侧)从 0~360°的不同方向与DNA 小沟对接后，可形成一系列酚基 -DNA 复合物[52]Fig.3 A number of phenol-DNA complexesshould be obtained for every docking by therotations of phenol molecule (at the left side)from 0 to 360 degrees with an angleincrement[52]从图2 中多酚类物质的结构可见，与葡萄糖相连的鼠李糖或芹糖决不是可有可无的，它们为确保多酚的羟基与DNA 碱基维持在 3 魡 的确切距离上而起着几何阻挡作用[53]，鼠李糖或芹糖像小船舷旁挂的旧轮胎，防止船体撞坏码头。生物进化是多么精确和神奇！天生我材必有用(李白语)，大自然不允许奢华(电子生物学之父、诺奖得主 Szent-Gyorgyi 语)，这是富有启迪性的科学哲学思想，同时对人工合成多酚类化合物也有提示作用。至此，我们从化学反应和计算机化学两方面确证了快速修复的电子转移机制。快速修复的构效关系从图 2 所示多酚类的结构可见，VER、PED A 和 CIS C 由糖基构成的主干的两侧均为多酚基团，其中长臂(左侧)含有 3 个碳并有双键，所以活动度受到限制，称为苯丙烯酰基；另一短臂(右侧)只有 2 个碳且均为单键，所以活动度大，称为苯乙基。其余三种多酚类只有一个臂，其中 SAL 只有短臂，几乎没有快速修复能力 (表 1)；而 FG 和 HCG 都是长臂，且都有修复能力(虽远弱于前述三种多酚类) (表 1)。由此推测，多酚类的长臂 (苯丙烯酰基)在修复中起主要作用，它的臂长且有刚性，容易嵌入 DNA 双螺旋小沟；如果臂短且缺乏刚性，则不易嵌入小沟[53]。

快速修复的安全性

DNA结构十分精巧，在各种微弱外力作用下都会发生立体几何变形，进而引起功能变化，包括癌变[55]。为此，我们考察了多酚与DNA 对接过程中由于分子力相互作用而对DNA构型产生的影响。将多酚类分子从 0～360°的不同方向靠近DNA，可形成一系列酚基 -DNA 复合物 (图 3)。这时，DNA 双螺旋结构的几何纵轴虽受到微拢，但基本上仍保持一条直线[52]，表明 DNA 的构型不因多酚化合物的靠近而发生明显变化，从而保证 DNA发挥正常功能。简言之，多酚类在发挥快速修复的作用中是安全的。这一结论与小白鼠整体的急性毒性测试结果是一致的[56]，表现为每天腹腔注射 VER (2 g/kg 体重）1 次，连续 14 天，小白鼠的行为、外观和体重都正常，心肝胃肾的肉眼观察及病理切片也都正常。由此可见，快速修复过程在分子层面和活体层面都是安全的。

快速修复与癌的关系

DNA 损伤是各种癌的共同分子基础[57]，成为癌的标志之一[56]，大量积累会导致基因不稳，进而癌变。另一方面，DNA 修复能力低下也是癌的标志之一[12]，缺失修复能力的小鼠基因不稳，易患癌[13,59]。缺乏修复能力的人类也易患癌[60]，如非息肉性结肠癌[61,62]。遗传性干皮色素沉着病患者的DNA 修复能力低下，他们患皮肤癌的风险要比正常人高 1000 倍，患舌鳞状上皮癌的风险高10 万倍，还易患乳腺癌、子宫癌、淋巴癌、白血病和结肠息肉病等；他们患癌的年龄也大大提前，平均8 岁就出现，而修复能力正常的人一般会推迟到 50岁以后[63]。由此推测，加强修复能力应能阻止癌变。下文用我们在分子、细胞和整体三个层面的研究来支持这一推测。

快速修复可维护基因的稳定

造成 DNA 瞬态损伤的物质有三大类：DNA-OH•加合物、DNA 阳离子自由基及阴离子自由基。许多代谢过程能使 DNA 氧化生成 DNA 阳离子自由基，例如嘌呤脱水可生成阳离子，辐射可直接导致DNA阳离子的产生。水合电子极易与 DNA 碱基发生反应而生成 DNA阴离子自由基。数以千计的致癌物中，数 OH•的作用最强，它以极快速度攻击 DNA 而形成 DNA-OH•加合物。我们用分子模型法研究发现，遭 OH•攻击后，碱基对的距离增大，导致碱基对氢键断裂[51～53]。图 1 上排黑色方块内圆圈和图 4A 圆圈突出显示了 DNA-OH•加合物碱基对氢键的断裂，如果细心查找还可在圆圈外找到另外 3 个断裂的碱基对。碱基对断裂的DNA 双螺旋结构很不稳定，易发生下沉 (图 4B)[54]。近来的研究发现，细胞表面哪怕受到压力、切力、张力和流体力学等微弱的外力，都会引起表型基因染色体重建、基因表达异常甚至癌变[64,65]，更不待说DNA 双螺旋结构下沉了。这是 DNA 瞬态损伤导致基因不稳定的典型例子。基因不稳是癌变的起因[57,59]，这三大类DNA 瞬态损伤都会引起DNA断裂，破坏基因稳定性，最终产生癌变[66,67]。而如前所述，快速修复可减少 DNA 瞬态损伤，从而维护基因的稳定，在癌变最早阶段实现抢救，及早阻断癌变的发展。本组所研究的植物多酚类都能快速修复这三大类 DNA瞬态损伤。

快速修复可削弱癌的特征标志

既然快速修复可维护基因的稳定性，那么，快速修复也应该能有力地阻止癌变，削弱癌的特征。2000年，Cell上发表的一篇论文总结了癌的 6 大特征标志 (2011 年又新增了 4 大标志[68])，该文 10 年内被他引了 1 万次，打破了所有论文的他引次数，连续 4 年每年下载 2 万次，足见其权威性和公信度。表 2 根据本组及其他文献资料，总结了一些具有快速修复能力的植物多酚类在削弱癌特征标志方面所发挥的作用。表 2 列出的具有快速修复功能的 14 种植物多酚类都能不同程度地削弱癌的特征。但是玄参科植物中的Angoroside C虽有快速修复能力[21]，但至今未见抗癌能力的报道。

毛蕊花甙及其类似物

毛蕊花甙(VER)可抑制人白血病细胞 HL-60 的增殖、诱导癌细胞逆转成单核细胞[69]；阻止黑色素瘤细胞向肺转移[70]；抑制人胃腺癌细胞增殖，减少细胞表面电荷，使细胞表面微纤毛脱落。以上 3 个指标虽均表明癌的恶性程度已经削弱，但最关键的考察还在于癌细胞的行为，未经VER 处理的人胃腺癌细胞移植到裸鼠皮下后，植瘤率为 100%，癌块很大；经VER处理后，植瘤率仅为 25%，即使长成的癌块也极小[71]。人胃癌细胞染色体端粒酶活性和端粒长度得到明显抑制，因此促进了癌细胞的凋亡[73]。VER 还可明显抑制癌血管的生成[74]，抑制人纤维肉瘤细胞的扩散[75,76]。马先蒿甙G (PED G)是VER 的同分异构体，仅在构象上有细微差别。它与 VER 一样，可明显抑制癌细胞的迁移、血管生成和癌块长大[78]。CIS C 与 VER 和 PED G 同属苯丙素甙类，它能抑制人肝癌细胞、人肺腺癌细胞和人胃腺癌细胞的增殖[75]。

茶多酚

茶多酚(teaphenols)与DNA 可发生对接[93]，并快速修复DNA 自由基[24]，减少人肝癌细胞 DNA 的损伤，抑制增殖，减少癌细胞表面电荷和微纤毛[92]，抑制肺癌血管的生成[93]，抑制癌细胞侵袭扩散[91]，阻断信号传导途径和有丝分裂信号[85]。

黄酮类

槲皮素( quercetin)和芦丁( rutin)是食物多酚类的主要成分，二者均能预防结直肠癌[95]，促进癌细胞凋亡[96,100]，阻止胰腺癌扩散[98]。槲皮素可抑制人乳腺癌细胞中突变 p53 蛋白的表达[99]。芦丁可抑制黑色素瘤的扩散[101]。草飞蓟素( salybin)用作抗癌的前景最好，已进入临床试验阶段，考察其抗前列腺癌[102]、卵巢癌[102]、皮肤癌[103]的疗效。人们还发现它能抑制人肝癌细胞基质金属蛋白酶 9(MMP-9)的释放[104]。MMP-9 是血管生成酶，直接控制人肝癌的成瘤率、侵袭和扩散。

结论与展望

细胞癌变是多步骤过程，一切致癌物都能攻击 DNA，造成 DNA 的瞬态损伤，导致基因失稳。只有快速修复机制能修复 DNA 瞬态损伤，而植物多酚类的快速修复能力在癌变第一时间发挥了阻击作用。与酶性修复相比较，快速修复有如下特点：1) 专一性地修复 DNA瞬态损伤而非稳态损伤；2) 修复速度比酶性修复快十亿倍；3) 没有酶的参与。快速修复、酶性修复和活性氧清除剂这三大防御系统分工合作，共同起到防御 DNA 损伤的作用(图 5)。虽然已经证明植物多酚类能快速修复DNA 一级和二级结构不同层级的损伤，但是尚无修复三级和四级结构损伤的报道，尚待深入研究。DNA 瞬态损伤除引起癌变外，还能与蛋白质、脂类和糖类反应，引起衰老和退行性疾病，例如 Alzheimer 病、Parkinson 病、心脑血管病、糖尿病、白内障、认知障碍和各种炎症等，推测快速修复理应也能防治这些疑难病，值得扩大研究范围。已有人研究快速修复与 Parkinson 病的关系[113]。除植物多酚类外，还有许多种物质具有快速修复能力，也待发掘。在活体中深入研究快速修复的现象和机制是走向临床医学的关键，虽已有直接检测活体内 DNA 自由基的新技术[4,5]，但仍期待发明简化和省钱的其它新检测技术，以便广大研究者参与。