自体骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死后心衰的实验研究

【前言】自体骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死后心衰的实验研究由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。【关键词】 骨骼肌卫星细胞; 细胞移植; 心肌梗死; 心功能 0引言 目前对缺血性心肌损伤的治疗主要集中于改善心肌的血供，减轻心肌缺血的症状，不能从根本上解决导致心衰的原因. 近年有研究发现，骨骼肌卫星细胞心肌移植可以改善心功能，从而为心衰的治疗提供了一条新的...

作者：徐清斌 张馥敏 杨志健 陈亦江 高翔 钱漪 马文珠 【关键词】 骨骼肌卫星细胞

Effects of autologous satellite cells transmplantation on cardiac function in acute myocardial infraction

【Abstract】 AIM: To study the effects of autologous skeleton muscle satellite cells (SC) transplantation on cardiac function in acute myocardial infraction (AMI). METHODS: The proximal potion of left anterior descending coronary artery (LAD) was ligated in young pigs to establish the AMI model and the young pigs were as donors and recipients of autologous SC transplantation. In treatment group, SC were isolated from skeleton muscle, cultureexpanded and labeled with DAPI. The SC were implanted into AMI area through intramyocardium. In control group (n=5), the same volume of cell culture medium was implanted into AMI area through intramyocardium. Gate cardiac blood pool was performed at the end of 1 and 4 weeks after AMI, respectively. The cardiac specimens were harvested for pathological examination at the end of 4 weeks. RESULTS: SC were spindleshaped and adhered on the bottom of the flask after 48hour culture. If calf bovine serum concentration decreased to 20 mL・L-1, SC commenced the fusion process, which resulted in the formation of multinucleated myotubes. New islands and striated muscles were found in treatment group at the site of implantation. The new muscles cell didn't show histological evidence of intercalated discs and centrally located nuclei. Left ventricular ejection fraction (LVEF) increased both in treatment group and control group, but LVEF was higher in treatment group than that in control group ［(40±2)% vs (33±2)%, P<0.01］, and 1/3 filling fraction were greater in treatment group than that in control group (0.60±0.07 vs 0.54±0.29, P<0.05). CONCLUSION: SC can differentiate into striated muscles under cardiac microenvironment and SC transplantation can improve both systolic and diastolic function of infracted heart.

【Keywords】 skeleton satellite cell; cell implantation; myocardial infraction; cardiac function

【摘要】 目的：研究骨骼肌卫星细胞植入梗死区心肌组织后对心功能的影响. 方法：幼猪10只，对照组和治疗组各5只. 治疗组从幼猪三角肌群处切取骨骼肌标本，获取卫星细胞，体外培养扩增，结扎冠状动脉建立幼猪的急性心肌梗死模型，通过局部注射的方法将卫星细胞植入梗死周边区及梗死区心肌. 对照组以同样的方法建立心肌梗死模型，予以等量的、不含卫星细胞的培养液接种，观察移植4 wk后卫星细胞移植对心功能的影响. 结果： 卫星细胞接种培养后48 h开始贴壁，细胞呈梭形，将细胞培养液中胎牛血清浓度降至20 mL・L-1以下时，细胞生长停滞，相互融合形成肌管;HE染色治疗组梗死区可见岛状、带横纹的肌肉组织，肌细胞核位于周边，光镜及电镜移植细胞及移植细胞与宿主细胞之间均未见闰盘连接；对照组梗死区为均匀一致的纤维疤痕组织; 对照组1 wk左室射血分数（LVEF）为(23±2)%，4 wk为(33±2)％，治疗组1 wk为(26±3)％，4 wk为(40±2)%，治疗组与对照组1 wk比较，无统计学差异（P>0.05）；而1 wk与4 wk比较，有统计学差异（P<0.001），治疗组与对照组4 wk比较，LVEF有统计学差异（P<0.01）. 治疗组1 wk与4 wk比较，1/3充盈分数（1/3FF）有统计学差异（P<0.05）. 结论：骨骼肌卫星细胞植入心肌梗死区可以分化、转归为带横纹的肌细胞，并能改善左室收缩及舒张功能.

【关键词】 骨骼肌卫星细胞; 细胞移植; 心肌梗死; 心功能

0引言

目前对缺血性心肌损伤的治疗主要集中于改善心肌的血供，减轻心肌缺血的症状，不能从根本上解决导致心衰的原因. 近年有研究发现，骨骼肌卫星细胞心肌移植可以改善心功能，从而为心衰的治疗提供了一条新的途径. 我们拟将幼猪的自体骨骼肌卫星细胞移植致心肌梗死区，研究其对心梗后心衰的治疗作用，从而为临床应用奠定基础.

1材料和方法

1.1材料苏中幼猪10只，均为雄性，体质量(30±5) kg. 随机分为治疗组和对照组(n=5). M199细胞培养液,透明质酸酶,胶原酶和DAPI(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Gibco公司);CO2恒温孵育箱(美国Forma公司)；E800型荧光显微镜(日本Nicon公司)；JEOLJEM0101型透射电子显微镜(日本)；ECAM+型单光子发射计算机断层扫描仪（SPECT,德国西门子公司).

1.2方法①骨骼肌卫星细胞的提取、纯化、培养及标记：无菌条件下从幼猪的三角肌肌群处切取3~5 g骨骼肌标本，采用酶消化法进行细胞培养，将细胞接种于含200 mL・L-1胎牛血清的M199细胞培养液中，37℃, 50 mL・L-1 CO2孵箱中进行培养；待细胞密度达到80%左右时进行传代培养，体外传代培养3~4 wk，细胞扩增至总数1×107・mL-1以上准备移植. 移植前24 h以0.2 g・L-1的二脒基苯基吲哚（4′6diamidino2phenylindole, DAPI）标记过夜. 移植前1 h收集细胞，漂洗3次除去未结合的DAPI及细胞培养液中的胎牛血清，悬浮于4 mL无胎牛血清的M199培养液中用于移植；②幼猪急性心肌梗死模型建立：氯胺酮(15 mg・kg-1)肌注诱导麻醉，建立耳缘静脉通路，气管插管，人工呼吸机辅助通气，成功后采用琥珀胆碱、芬太尼、氨氟脒复合麻醉；胸骨正中切口开胸，剪开心包，暴露心脏，在左冠状动脉前降支第一、第二对角支间结扎左前降支. 结扎前给予肝素（50 U・kg-1）、利多卡因（2 mg・kg-1）静脉注射，继以利多卡因（1 mg・kg-1）持续静脉滴注. 结扎2 h后松开结扎线. 整个过程持续心电监护；③ 卫星细胞移植：结扎线松开后约15 min，将预先准备好的4 mL细胞悬液用25G的注射针接种于形成的心肌梗死的周边区及梗死区，注射深度2 mm，每次注射0.1 mL. 对照组以同样的方法建立心肌梗死模型，予以相同量的、含0.2 g・L-1 DAPI的M199培养液接种. 接种完毕观察无出血后缝合部分心包，逐层关胸. 自主呼吸恢复后拔除气管插管，送动物房继续饲养；④心功能评价：细胞移植后1和4 wk，再次麻醉动物（戊巴比妥钠 30 mg・kg-1），行门控心血池检查评价心功能; ⑤ 病理检查：细胞移植4 wk后，氯胺酮肌注麻醉，颈动脉切开放血处死动物，左侧切口进胸，取出心脏，迅速切取小块梗死区标本，50 g・L-1戊二醛固定，送电镜检查，其余标本40 g・L-1的甲醛固定，病理检查.

统计学处理：结果以x±s表示，采用重复测量数据的方差分析.

2结果

2.1星细胞的体外培养、鉴定卫星细胞接种培养后48 h开始贴壁，细胞呈梭形，待细胞密度达到70%左右时，进行传代培养，细胞仍呈梭形或星形（Fig 1）. 将细胞培养液中胎牛血清浓度降至20 mL・L-1以下时，细胞生长停滞，相互融合形成肌管（Fig 2）. DAPI标记阳性，标记效率为100%.

图1－图2 (略)

2.2骨骼肌卫星细胞移植对收缩功能的影响对照组、治疗组1 wk与4 wk左室射血分数（LVEF）比较，均有统计学差异（P<0.001）；治疗组与对照组1 wk比较，无统计学差异；治疗组与对照组4 wk比较，LVEF有统计学意义（P<0.01）. 对照组与治疗组高峰射血率（PER）、1/3射血分数（1/3EF）比较，1 wk与1 wk, 1 wk与4 wk, 4 wk与4 wk，均无统计学意义（Tab 1）.

表1自体卫星细胞移植对收缩功能的影响　(略)

2.3骨骼肌卫星细胞移植对舒张功能的影响对照组与治疗组比较，高峰充盈率（PFR）1 wk与1 wk, 1 wk与4 wk，均无统计学意义；1/3充盈分数（1/3FF）治疗组1 wk与4 wk间有统计学意义（P<0.01），其余各组间均无意义（Tab 2）.

表2自体卫星细胞移植对舒张功能的影响　(略)

2.4卫星细胞移植致心肌再生大体标本示对照组梗死区为白色致密的疤痕组织，治疗组疤痕组织中可见肌肉组织生长；HE染色治疗组梗死区可见岛状、带横纹的肌肉组织，肌细胞核位于周边，细胞之间未见闰盘连接（Fig 3）；对照组梗死区为均匀一致的纤维疤痕组织，其中无肌细胞存在（Fig 4）. 电镜检查：治疗组梗死区见带横纹肌肉组织，肌细胞之间未见闰盘连接（Fig 5），对照组梗死区则为纤维组织，未见肌细胞.

3讨论

骨骼肌卫星细胞，呈梭形或星形，位于骨骼肌和基膜之间，一般情况下，处于静止状态，当骨骼肌受损时,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖，分化为骨骼肌细图3治疗组梗死区新出现岛状、带横纹的肌细胞

图4－图5 (略)

胞. 骨骼肌细胞与心肌细胞同为横纹肌，在胚胎发育期具有一个共同的过程，即由间质细胞分化为肌细胞，因而有学者推测，骨骼肌卫星细胞在心脏环境中可发生环境依赖性分化，而生长为心肌样细胞，达到心肌再生的目的［1］. 我们的研究发现，提取的细胞呈梭形，降低细胞培养液中胎牛血清浓度，细胞可以融合成肌管，确认细胞为骨骼肌卫星细胞. 移植至梗死区后，这些细胞分化为带横纹的肌细胞，未见这些细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间形成闰盘联结. 表明卫星细胞心肌移植并未形成心肌细胞，但可以修复心肌损伤.

心功能检查发现，卫星细胞移植组LVEF明显好于对照组，PER, 1/3 EF变化虽未显示统计学变化，但亦呈增高趋势，这也于Jain等［2-4］的研究结果相一致. Atkins等［5］通过微压测量和声微测量，发现移植成功组心肌张力明显增加，动态硬度显著降低，提示心室顺应性改善，而在移植未成功组，相关参数则出现恶化，我们也发现治疗组1/3充盈分数明显改善，提示左室舒张功能有所改善，对照组则无变化. 其原因可能移植的细胞一方面通过环境依赖性分化使新生肌肉细胞由不耐疲劳的快收缩肌转变为耐疲劳的慢收缩肌，以主动适应心肌收缩的需求；另一方面通过肌肉再生降低心室的僵硬度，增加梗死区室壁厚度，限制心室重构等被动途径来改善心脏的收缩和舒张功能［6,7］.

本研究亦有一些不足之处，样本例数过少，使心功能的一些参数虽呈改善趋势，但并无统计学差异；在病理切片中没有找到带荧光的细胞，可能由于移植时间过长，荧光衰变以及血流的冲刷、细胞复制时丢失等原因所致.

【参考文献】

［1］ Dorman J, Duong M, Zibaitis A. Myocardial tissue engineering with autologous myoblast implantation［J］. J Thorac Ardiovascsurg, 1998;116:744-751.

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［3］ Jain M, Dersimonian H, Brenner DA, Ngoy S, Teller P, Edge AS, Zawadaka A, Wetzel K, Sawyer DB, COlucei WS, APstein CS, Liao R. Cell therapy attenuates deleterious ventricular remodeling and improves cardiac performance after myocardial infarction［J］. Circulation, 2001;103(14):1920-1927.

［4］ Pouzet B, Vilquin JT, Hagege AA, DEsnos M, Duboc D, Marolleau JP, Menashe P. Factors affecting functional outcome after autologous skeletal myoblast transplantation［J］. Ann Thorac Surg, 2001; 71:841-851.

［5］ Atkins BZ, Hueman MT, Meuchel J, Cottman MJ, Hutchesonka, Taylor DA. Myogenic cell transplantation improves in vivo regional performance in infracted rabbit myocardium［J］. J Heart Lung Transp, 1999; 18:1173-1180.

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［7］ Zheng QJ, Cai ZJ, Yu SQ, Yang Y, Hu J, Hu QX. Research on the Effects of fetal cardiomyocyte trapspantation［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2002；23（8）:695-697.