奥曲肽联合5-氟尿嘧啶对Hepa1-6肝癌细胞PAK1表达的影响

[摘要]目的研究不同浓度奥曲肽(OCT)及OCT联合5-氟尿嘧啶(5-Fu)对Hepa1-6肝癌细胞的作用效果，并探讨其可能的作用机制。方法 采用MTT法检测不同浓度OCT及OCT联合5-Fu对细胞活性的影响；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PAK1mRNA的表达；细胞划痕愈合实验测定细胞扩散运动能力。结果 不同浓度OCT及OCT联合5-Fu组细胞生长抑制率均随剂量的增加而增加，与对照组相比有显著差异(P＜0.01)，且联合用药组均明显高于相应浓度OCT及5-Fu组(P均

[关键词]肝细胞癌；奥曲肽；5-氟尿嘧啶； PAK1

[中图分类号] R969.4[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515（2010）-12-003-02

The effect of combinating octreotide acetate and 5-Fluorouracil for the expression of PA

Ping Mei1,2Zhao He-ping2

(1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001;2.Department of Synthetical Section,

the First Affiliated Hospital of Shanxi Medical Uiversity,Taiyuan 030001）

[Abstract]Objective To research the effect of different concentration of Octreotide Acetate（OCT）and OCT combinate 5-Fluorouracil(5-FU) on hepatoma(Hepa1-6) cell,and to explore its role in the mechanism.Methods MTT method was used to test the activity of the cell acted by assay of different concentrations OCT and OCT combinate 5-Fu;the expression of PAK1mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR);monolayer wound healing assay was used to detect Hepa1-6 cell motility.Results The inhibitory rate of cell growth in different concentrations of OCT and OCT combined with 5-Fu group increased with OCT dosage augment,and was significantly higher than that in controls(P＜0.01),and the combined treatment group were significantly higher than the corresponding concentration of OCT group and 5-Fu group(P

[Keywords] hepatocellular carcinoma; Octreotide Acetate; 5-Fluorouracil;PAK1

原发性肝癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，也是我国最常见且恶性程度最高的肿瘤之一。目前手术仍是治疗肝癌的首选方法，然而肝癌根治性切除后5年复发率高[1]，成为肝癌临床治疗的难题。近年发现生长抑素及类似物对多种实体肿瘤有抑制作用，也可增强多种抗肿瘤药物的抗肿瘤作用，且毒副作用小[2]。而5-Fu是目前肝癌化疗方案中的基础用药，国内外关于生长抑素联合5-Fu抗肿瘤研究甚少。本实验通过研究不同浓度奥曲肽及奥曲肽联合5-Fu对Hepa1-6肝癌细胞的作用，评估其治疗的疗效，并寻求治疗的最佳浓度及可能的作用机制，从而为肝癌治疗提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 小鼠Hepa1-6肝癌细胞、IAR20正常肝细胞购于中科院细胞库，用含体10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）及噻唑兰(MTT)购自武汉博士德生物工程有限公司。奥曲肽(0.1mg/支，北京星昊医药股份有限公司，批号：国药准字H20052374)；5-氟尿嘧啶(0.25g/10mL，上海旭东海普药业有限公司，批号H31020593)；Trizol试剂购自Gibco公司，GAPDH、PAK1引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2MTT法测药物抗癌活性 取对数生长细胞，常规消化以5×104/mL每孔150μL接种于96孔板，培养24h，随机分为8组(A、B、C、D、E、F、G、H组)，其中A组为对照组(不给予任何药物)，B、C、D组给予低、中、高浓度奥曲肽(1，4，10mg/L)，E、F、G组给予低、中、高浓度奥曲肽(1，4，10mg/L)同时给予7.5mg/mL的5-Fu，H组只给予7.5mg/mL的5-Fu[3]，并设空白对照，作用24h，加MTT液(5mg/mL)10μL，孵育3-4h，弃上液。每孔加150μLDMSO，振荡5min。酶标仪492nm波长处测OD值，计算细胞生长抑制率。抑制率=(空白对照组OD均值-用药组OD均值)/空白对照组OD均值×100%。

1.3 RT-PCR法测PAK1mRNA表达 设正常肝细胞组(Z组)，对照组(A组)、奥曲肽10mg/L组(D组)、奥曲肽10mg/L+5-Fu组(G组)。常规细胞传代、培养，待细胞生长至融合后，Z、A组换新鲜培养液2ml，D组加入奥曲肽10μg/mL2ml，G组给予奥曲肽及5-Fu终浓度分别为10μg/mL、7.5mg/mL总液量2ml，培养24h，收集细胞，以Trizol试剂提取细胞总RNA，并取2mg行逆转录，PCR扩增PAK1，PAK1引物为：5，-ACCATGGTGGGAACTCCATA-3，(正义)，5，-CATCTCAAGACAGCGGTTCA-3，(反义)，片段246bp，反应条件：94℃30s，58℃1min，72℃1min30s，30个循环，以GAPDH为内参照，引物为5，-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，(正义)，5，-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3，(反义)，片段307bp，反应终止后，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 划痕愈合实验测细胞扩散运动能力 设A、D、G组(分组同1.3实验)，将对数生长期细胞以5×105/孔接种于六孔板，每孔2ml，待细胞生长至融合，用无菌10μL加样枪头在细胞表面划痕，PBS洗去漂浮细胞，A组换新鲜培养液2ml，D、G组加药方法同1.3实验，在划痕后24h观察划痕边缘细胞向空白区扩散运动情况，并计数迁移到划痕区的细胞数，至少计数五个视野。

1.5 统计学分析 数据以（x±s)表示，比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MTT实验结果

单药OCT及联合用药组细胞生长抑制率均随药物浓度的增加而增加，与对照组相比有显著差异(P均＜0.01)，且联合用药组均明显高于相应浓度OCT及5-Fu组(P均

2.2 各组细胞PAK1mRNA的表达

细胞PAK1mRNA经RT-PCR分析(图1)表明，正常肝细胞中仅少量表达PAK1mRNA(0.3502±0.0302)，奥曲肽10mg/L组、奥曲肽10mg/L+5-Fu组PAK1mRNA表达(分别为1.2650±0.0075、0.9715±0.0100)均较肝癌细胞组(1.499±0.0252)减少，但高于正常肝细胞组(P均

1-4：依次为正常肝细胞组、肝癌细胞组、

奥曲肽10mg/L组、奥曲肽10mg/L+5-Fu组

图1各组细胞PAK1mRNA的表达

2.3 不同药物对肝癌细胞扩散运动能力的影响

肝癌细胞组、奥曲肽10mg/L组及奥曲肽10mg/L+5-Fu组，三组细胞在划痕损伤24h后肝癌细胞组划痕边缘有细胞移动，划痕面积明显缩小，划痕区内细胞数26.75±2.92，奥曲肽10mg/L组细胞划痕边缘模糊，划痕区内细胞数9±2，而奥曲肽10mg/L+5-Fu组细胞划痕边缘较整齐，划痕面内未见明显细胞移动。

3 讨论

研究发现，奥曲肽半衰期较天然生长抑素显著延长且无停药后反跳高分泌现象[4]，其对多种胃肠道肿瘤有抑制作用[5,6]，但其抗肿瘤机制目前尚未完全明了。本研究采用MTT法检测不同浓度奥曲肽、奥曲肽联合5-Fu及5-Fu对Hepa1-6肝癌细胞的抑制作用，结果显示奥曲肽联合5-Fu对细胞的抑制作用增强，且奥曲肽10mg/L联合5-Fu抑制作用最强。

PAK1(P21-activated kinase 1，P21-激活激酶1)是一潜在的癌基因，其异常已被证实与乳腺癌、大肠癌、白血病等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[7,8,9]，而其在肝癌中的表达及药物作用研究，国内外罕见报道。本研究采用RT-PCR技术检测PAK1mRNA的表达，结果显示正常肝细胞中PAK1仅少量表达，奥曲肽10mg/L联合5-Fu组、奥曲肽10mg/L组PAK1mRNA的表达均较肝癌细胞组减少，其中奥曲肽10mg/L联合5-Fu组PAK1mRNA的表达低于奥曲肽10mg/L组。提示奥曲肽10mg/L联合5-Fu通过减少PAK1癌基因的表达发挥其抗肿瘤作用。

肿瘤细胞移行是肿瘤形成的重要条件，也是肿瘤向远处器官转移所必需的。本研究我们采用划痕愈合实验观察奥曲肽及奥曲肽联合5-Fu对肝癌细胞移动能力的影响，结果显示，肝癌细胞组细胞移行运动能力最强，24h后肝癌细胞组划痕边缘有细胞移动，划痕面积明显缩小，奥曲肽10mg/L及奥曲肽10mg/L+5-Fu组细胞移行运动能力较肝癌细胞组均有不同程度下降。提示奥曲肽10mg/L联合5-Fu通过降低细胞移行能力来抑制肿瘤的增长及转移。

研究表明，10mg/L的奥曲肽联合5-Fu为抑制肿瘤的最佳药物浓度。奥曲肽联合5-Fu可通过减少PAK1癌基因的表达、降低细胞移行运动能力而抑制肿瘤的发生发展。这将为今后联合用药提供一定的理论依据。

参考文献

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