雷诺昔酚对去势后大鼠骨密度、血生化指标的影响

【关键词】 ,卵巢切除术

Influence of SERMraloxifene on bone mineral density and blood biochemical parameters in ovariectomized rats

【Abstract】 AIM: To study the influence of raloxifene (RAL), a selective estrogen receptor modulator (SERM), on bone mineral density（BMD） loss in cancellated bone and compact bone of ovariectomized rats. METHODS: Twentyfour female SD rats were divided into 3 groups (8 rats per group): sham operation group, ovariectomized（OVX） group and therapeutic（OVX+RAL） group. Bilateral ovariectomies were performed in OVX group and OVX+RAL group. The latter was treated with raloxifene 7 d after operation. Sixteen weeks after operation, all rats were sacrificed. BMD of L3L5 vertebrae, proximal femoral segment and femoral shaft were measured by dual energy Xray absorptiometry (DEXA). L2 vertebrae were histomorphometrically analyzed and serum biochemical markers were measured before and after drug administration. RESULTS: Serum total calcium ［（3.02±0.38） mmol/L vs（2.24±0.30） mmol/L］ and total alkaline phosphatase ［（2.336±0.032） μkat/L vs （1.832±0.028 ）μkat/L］ significantly increased in OVX group compared with those in sham group (P<0.01, P<0.05 respectively). The above parameters decreased in RAL group compared with those the ovariectomized group ［（2.38±0.39） mmol/L vs（3.02±0.38）mmol/L,（1.952±0.023） μkat/L vs （2.336±0.032） μkat/L］ (P<0.05). Sixteen weeks after ovariectomy, BMD of L3L5 vertebrae, proximal femoral segment ［（0.181±0.021） g/cm2 vs （0.287±0.025 ）g/cm2］ and femoral shaft ［（0.157±0.034） g/cm2 vs （0.260±0.039） g/cm2］ decreased significantly (P<0.01) and the trabecular became thin and irregular compared with those in sham group. After treatment of RAL, the above parameters restored (P<0.05) but not to the level of sham group (P>0.05). CONCLUSION: Ovariectomy induces a significant decrease of cancellated bone mass and compact bone mass. RAL is an effective medicine to inhibit bone loss, increase the BMD of lumbar spine, total hip bone and total body and decrease the bone turnover.

【Keywords】 ovariectomy；osteoporosis; selective estrogen receptor modulator；raloxifene; metabolism; bone density

【摘要】 目的：研究选择性雌激素受体调节剂(SERM)雷诺昔酚（RAL）对去势后雌性大鼠血生化及骨密度(BMD)的影响. 方法： 将5 mo龄未经产雌性二级SD大鼠24只，随机分为假手术(Sham)组、去势(OVX)组、去势＋RAL(OVX+RAL)组. OVX+RAL组大鼠术后7 d开始给药. 术后16 wk处死各组大鼠，对各组大鼠血生化指标、BMD进行检测，并进行骨组织形态学观察. 结果：OVX组与Sham组相比较，血钙（Ca2+）明显增高［（3.02±0.38） mmol/L vs（2.24±0.30）mmol/L, P<0.01］，血碱性磷酸酶(ALP)升高［（2.336±0.032） μkat/L vs (1.832±0.028) μkat/L, P<0.05］，血磷(P)无明显差异. OVX+RAL治疗组与OVX组相比，血清Ca2＋，ALP均降低［（2.38±0.39） mmol/L vs (3.02±0.38) mmol/L, (1.952±0.023) μkat/L vs (2.336±0.032) μkat/L, P<0.05］，血P无明显差异. 与Sham组相比，OVX组股骨近端［（0.181±0.021） g/cm2 vs (0.287±0.025) g/cm2］、股骨干［（0.157±0.034） g/cm2 vs (0.260±0.039) g/cm2］及腰椎BMD明显降低(P<0.01)；OVX+RAL治疗组各部位BMD高于OVX组(P<0.05)，但未达到Sham组水平(P>0.05). 结论：去势后16 wk大鼠松质骨、皮质骨骨量、骨组织形态计量学指标均明显下降．经RAL治疗后的去势大鼠松质骨、皮质骨密度、骨组织形态计量学指标得到较好维持.

【关键词】 卵巢切除术；骨质疏松；选择性雌激素受体调节剂；雷诺昔酚；代谢；骨密度

0引言

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMO）是一种严重危害中老年妇女健康的代谢性疾病，以骨转换加快，成骨与破骨失去平衡，骨量减少和骨组织显微结构受损为特点，继而引起骨骼脆性和骨折危险性增加. 目前临床上主要是通过雌激素替代疗法来预防和防治PMO，其骨保护作用主要是通过抑制破骨细胞的增殖和活性，减缓和抑制骨吸收，促进成骨作用来实现的. 但其存在体质量增加、不规则阴道出血、痛、子宫内膜增生等副作用，长期应用会增加乳腺癌和子宫内膜癌的危险性［1,2］. 雷诺昔酚(RAL)是一种选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator，SERM)，对骨组织具有雌激素样骨保护作用，在乳腺和子宫则具有拮抗雌激素的作用，使用RAL预防和防治PMO可以避免雌激素替代疗法对机体产生的副作用. 我们探讨RAL对去势后大鼠PMO形成过程中骨密度(BMD)和血生化指标的影响.

1材料和方法

1.1材料

5 mo龄未经产雌性二级SD大鼠24只，体质量（300±25）g，购自第四军医大学实验动物中心. 随机分为3组：假手术(Sham)组、去势(OVX)组、OVX+RAL组，每组8只. 组间大鼠体质量无统计学差异. 所有大鼠均以30 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg, ip）麻醉，在无菌条件下手术，取背部切口. 分离、结扎、摘除OVX组、OVX+RAL组大鼠双侧卵巢，分层缝合关闭切口. 分离、提出Sham组大鼠双侧卵巢后，放回腹腔. 术后7 d开始将RAL片剂(美国礼来公司产品)碾碎制成浓度为0.3 g/L的生理盐水悬液，按每只1 mg/（kg・d）给OVX+RAL组大鼠灌胃. Sham组、OVX组大鼠按每只3 mL/(kg・d)用生理盐水灌胃. 术后3组大鼠均在二级环境下分笼饲养，给予标准饲料，自由摄水. 3组大鼠均于术后16 wk后处死. 各组大鼠ip麻醉，经左心室取血4 mL，离心（3000 r/min） 15 min，取上清液作血标本，-20℃冰箱保存. 取各组大鼠股骨、腰椎用于测量BMD. 取L2椎体，40 g/L中性甲醛固定，脱钙后常规石蜡切片，切片厚度4 μm，HE染色.

1.2方法

1.2.1血液生化指标测定血清Ca2＋用邻甲酚酞络合酮比色法，血P用亚铁磷钼酸法，血碱性磷酸酶(ALP)用对硝基苯磷酸水解法，均用PBC半自动生化分析仪测定.

1.2.2BMD测量使用Lunar公司的DPXIQ型7040双能X线吸收测量平台，通过计算机中小动物软件系统测股骨颈基底部、股骨干中点及第3～5腰椎中点BMD.

1.2.3骨组织形态计量学分析及形态学观察采用德国Leica公司M550型计算机全自动图像分析系统测量参数，观察每只大鼠组织切片2张，测定骨量参数：① 骨小梁体积BV／TV（％）（骨小梁面积／髓腔和骨小梁面积×100%）；②骨小梁平均厚度（Tb.Th）（μm）；③皮质骨平均厚度（μm）. 组织形态学观察，光镜下观察L2椎体HE染色切片形态学特征.

统计学处理：采取SPSS软件进行统计分析，所有测量参数均以x±s表示. 组间差别比较采用方差分析及LSDt检验.

2结果

2.1血液生化指标OVX组与Sham组相比较，血Ca2＋值明显升高（P<0.01），ALP升高（P<0.05），血P无明显差异；OVX+RAL组与Sham组相比较，血Ca2＋，ALP值均明显升高（P<0.05），血P无明显差异（Tab 1）.表1各组血液生化指标ALP，Ca2+，P测定值（略）

2.2OVX组与Sham组比较术后16 wk皮质骨及松质骨BMD均明显降低. 股骨近端、股骨干、L3～5椎体BMD均明显下降（P<0.01）；OVX+RAL组与OVX组比较，股骨颈基底部、股骨干BMD均明显高于OVX组（P<0.01）；OVX+RAL组与Sham组比较，股骨近端、股骨干BMD均明显低于Sham组（P<0.01, Tab 2）.表2各组BMD测定值比较（略）

2.3形态计量学和光镜下观察与Sham组比较，OVX组骨小梁体积、骨小梁平均厚度、皮质骨厚度显著下降（P<0.01）. OVX+RAL组与OVX组相比，上述各参数均得到改善（Tab 3）.表3各组大鼠腰椎骨组织形态计量学参数比较（略）

腰椎HE切片光镜下观察见OVX组腰椎骨小梁明显稀疏，皮质骨变薄，小梁及间隙增大，部分区域骨小梁消失，对照组及治疗组腰椎骨小梁丰富，骨皮质增厚，小梁间隔较小(Fig 1,2). Fig 1A~C分别为Sham组、OVX组、RAL治疗组腰椎骨小粱结构的组织学对比（箭头所指为骨小梁）；Fig 2A~C分别为Sham组、OVX组、RAL治疗组腰椎皮质骨组织学对比（箭头所指为皮质骨）.

3讨论

SERM是人工合成非甾体化合物，通过与雌激素竟争雌激素受体(ER)而发挥作用，能选择性的与骨细胞上的雌激素受体结合而抑制骨丢失. RAL是新一代SERM，有良好的组织选择性，对下丘脑、乳腺和子宫内膜无刺激作用［3］，对骨骼及心血管系统均具有保护作用. Cano等［4］认为，RAL对骨组织的作用是由配基类型、受体类型(ERa,ERβ)及结合器3个因素所决定. RAL与ER结合影响ER与特异DNA相互作用动力学，进而影响基因转录；因RAL与ER结合的亲和力、结合机制、诱导结果与雌激素不同，使RAL与雌激素同ER结合后形成的复合物存在结构差异，这种差异被细胞内特殊转录因子识别从而产生了与雌激素不尽相同的生物效应. ER包含两个转录结构域：AF1和AF2，两者在不同细胞的分布存在差别，RAL为AF2的拮抗剂，对AF2控制的细胞起抑制雌激素样作用；相反，在AF1占主导地位的受体中，它起协同作用. 骨组织中的ER受体以AF1为主，使得RAL对成骨细胞和破骨细胞具有雌激素样作用［5］. 研究表明［6］：ER与雌激素类物质结合后，激活多个位于DNA上的应答素(response element)，如雌激素应答素及RAL应答素，通过应答素来调节基因转录，影响蛋白合成. 人的成骨细胞、破骨细胞及骨细胞前体上均存在ER，RAL通过ER介导，刺激成骨细胞，抑制破骨细胞，调控骨的形成、吸收和骨改建.

去势后大鼠血清Ca2+，ALP酶明显升高，说明骨形成加快. 16 wk后的大鼠BMD明显下降，与Sham组相比，腰椎BMD明显下降（P<0.01），提示去势后松质骨骨量明显减少；股骨干BMD亦明显下降（P<0.01），提示去势后皮质骨骨量亦明显减少. 股骨近端BMD较Sham组亦明显下降（P<0.01），提示去势后大鼠皮质骨、松质骨骨量均明显丢失，总体上说明去势后大鼠骨改建呈高转换状态，骨形成和骨吸收同时增加，但骨吸收大于骨形成，骨形成和骨吸收的失衡最终导致了骨质疏松. RAL治疗后，大鼠血清Ca2＋及ALP明显降低，与Sham组已无明显差异，说明骨形成降低；同时，各部位BMD明显大于OVX组，松质骨、皮质骨BMD大于OVX组，骨小梁体积、骨小梁平均厚度、椎体皮质骨平均厚度均高于OVX组（P<0.01），与Sham组接近，说明RAL抑制了去势大鼠的骨高转换状态，纠正了骨形成和骨吸收的失衡，使骨形成大于骨吸收. 本研究显示，去势大鼠经RAL治疗3 mo后腰椎、股骨干、股骨近端BMD得到较好的维持，而未经RAL治疗的OVX组大鼠BMD却呈降低趋势，论证了RAL可以抑制和延缓骨质疏松的发生，对雌激素缺乏引起的骨质疏松有良好的防治作用.

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