甲基胺草磷加倍玉米单倍体效果的初步研究

摘 要：以高诱1号诱导的不同基因型玉米单倍体为材料，在3～5叶期用不同浓度的甲基胺草磷溶液进行滴心处理，研究甲基胺草磷加倍单倍体的效果。结果表明：不同浓度的甲基胺草磷溶液的加倍效率存在一定差异，100 μmol/L的甲基胺草磷溶液处理的单倍体加倍效率最高；不同遗传背景材料的加倍效果存在差异。

关键词：玉米；单倍体加倍；甲基胺草磷

中图分类号：S513.035.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）10-0029-03

周期长、效率低的常规育种方法不能满足玉米育种的需求，单倍体技术的出现给育种者带来了新的希望。利用单倍体技术选育自交系，可使材料的纯合从常规育种的6～8个世代缩短到2～3个世代，不仅大大缩短了自交系的选育周期，加快了育种进程，还可以实现配子的多样性选择，提高有利基因型的入选频率[1]。但是在玉米育种中想有效应用单倍体技术，还需要解决几个关键问题：如何简便且大规模地获得单倍体植株，如何简便且有效地进行单倍体加倍等。这些技术难题是目前制约单倍体技术发展的瓶颈[2]。本试验以高诱1号诱导的不同遗传背景的玉米单倍体为材料，在3～5叶期用不同浓度的甲基胺草磷溶液进行滴心处理，研究探讨玉米单倍体加倍的方法及其影响因素，为单倍体育种技术的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

父本诱导系材料为高诱1号，母本试验材料是3个杂交组合的F1代：金海5号×青农105、郑单958×青农105、农大108×青农105。加倍的化学药剂选用了西格玛-奥德里奇公司生产的纯度为 98%的甲基胺草磷。试验在青岛农业大学农学与植物保护学院莱阳试验站内进行。

2011年，通过选用的父本母本试材杂交诱导，从收获的杂交种子中鉴定挑选单倍体。共获得1 592个杂交果穗，收获221 121粒种子，经过遗传标记鉴定后，获得紫顶白胚籽粒准单倍体籽粒30 626粒，准单倍体诱导率为13.85%。次年，经过大田单倍体植株形态学鉴定后，确定单倍体植株7 496株，平均诱导率为3.39%。

1.2 加倍方法

使用1%的肥皂水、0.1%的吐温-80（TWEEN-80）溶液，将甲基胺草磷原液制成浓度为0、40、60、80、100、120和140 μmol/L的溶液。选择长势一致的单倍体幼苗， 待其长至3～5叶期时， 分别将以上溶液滴至单倍体植株的心叶处，每株约1 ml。不同浓度的溶液至少处理500株单倍体幼苗。

1.3 加倍率

单倍体植株开花后，采集一部分花药置载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，加1～2滴0.2%的I-KI溶液，压片，于低倍显微镜下观察。正常花粉内含淀粉遇碘变蓝色，活力低的花粉遇碘呈黄褐色。即加倍成功的单倍体植株花粉粒鉴定为蓝色，加倍不成功的为黄褐色。

单倍体加倍率=加倍成功株数/单倍体植株总数×100%

2 结果与分析

2.1 不同浓度甲基胺草磷溶液的加倍效果

不同浓度的甲基胺草磷溶液对不同基因型的玉米单倍体均有加倍效果，但不同浓度之间的效果存在一定差异（表1）。金海5号×青农105各处理的加倍率为4.96%～24.57%，其中40、60、80、100 μmol/L的加倍效果之间的差异达到了极显著水平；0 μmol/L（对照）与140 μmol/L之间达到显著水平；40 μmol/L与140 μmol/L、40 μmol/L与0 μmol/L（对照）以及 60 μmol/L与120 μmol/L之间差异不显著。郑单958×青农105各处理的加倍率为4.78%～23.36%，其中40 μmol/L与140 μmol/L之间差异不显著，其余各处理之间差异都达到了极显著水平。农大108×青农105各处理的加倍率为4.96%～24.84%，40、60、80、100、120 μmol/L处理的加倍率之间存在极显著差异； 40、140、0 μmol/L（对照）处理之间差异不显著。

由表1和图1知，不同处理中，用100 μmol/L的甲基胺草磷处理农大108×青农105的加倍效果最好，平均加倍率达到24.84%；用140 μmol/L的溶液滴心郑单958×青农105的加倍率最低，为4.78%。3种材料的最高加倍率都出现在100 μmol/L时，分别为24.57%、23.36%、24.84%。当浓度小于100 μmol/L时，加倍效率随浓度的增加而升高，从4.78%升到24.84%；浓度超过100 μmol/L 后，加倍率呈下降趋势。

2.2 不同基因型玉米单倍体的加倍效果

浓度为100 μmol/L甲基胺草磷对不同基因型单倍体加倍效果的方差分析见表2。不同基因型的加倍效果不同，其中以农大108×青农105为母本的单倍体的加倍率最高，达24.84%；其次为以金海5号×青农105为母本的单倍体，加倍率为24.57%；最低为以郑单958×青农105为母本的单倍体，加倍率为23.36%。以金海5号×青农105为母本的单倍体与以郑单958×青农105为母本的单倍体的加倍率之间差异极显著，与以农大108×青农105为母本的单倍体的加倍率之间差异不显著。

3 结论与讨论

6个不同浓度的甲基胺草磷对玉米的滴心处理都提高了玉米单倍体的加倍率，其中浓度为100 μmol/L时，效果最好。单倍体加倍率的高低也受母本材料遗传背景的影响。

3.1 不同浓度的甲基胺草磷对单倍体加倍的影响

Wan等（1991）[4]研究发现甲基胺草磷、拿草特、安磺灵和氟乐灵等4种除草剂对于玉米花药愈伤组织进行处理，均表现出一定的加倍效果。Jakse等（2003）[5]用50 μmol/L的甲基胺草磷处理洋葱的鳞茎获得了36.7%的二倍体植株。本试验在3～5叶期用6个不同浓度的甲基胺草磷对3种不同基因型单倍体进行滴心处理。所有处理的加倍率均高于自然加倍率，说明在3～5叶期对单倍体进行滴心处理加倍的方法有效。用浓度为100 μmol/L甲基胺草磷对单倍体进行加倍时，效果最好，表明，此浓度处理加倍是比较有效的方法。惠国强等（2012）[6]研究结果表明，甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵可以提高玉米单倍体的加倍率， 其中80 μmol/L甲基胺草磷的效果最好。这比本试验出现最高加倍率的浓度低，这可能与试剂的纯度、实验的环境以及材料的遗传背景等因素有关。当处理浓度小于100 μmol/L时，加倍率随着浓度的增加而升高；浓度超过100 μmol/L后，加倍率迅速降低。这可能是因为甲基胺草磷本身的药害作用，随着浓度的增加，药害也越严重，当超过一定值时，则会降低加倍效率。

3.2 不同基因型对单倍体加倍效果的影响

本研究发现同一浓度甲基胺草磷处理下，不同基因型的加倍率存在差异。在浓度为100 μmol/L时，3种材料的加倍率分别为24.57%、23.36%和24.84%。方差分析中，以金海5号×青农105为母本的单倍体与以郑单958×青农105为母本的单倍体的加倍率之间差异极显著，与以农大108×青农105为母本的单倍体的加倍率之间差异不显著。表明，单倍体的加倍效率受遗传背景的影响。Shatskay等（1994）[8]认为，单倍体雄穗育性的差异是受核基因控制的，并且表现加性遗传的特性，基因型不同其育性也有差异。这与惠国强等（2012）[6]用甲基胺草磷加倍玉米单倍体的研究结果相符。与魏俊杰等（2007）[9]使用秋水仙素溶液处理单倍体的研究结果一致， 即玉米不同基因型， 同一药剂的加倍率有显著差异。

参 考 文 献：

[1]

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[2] 岳尧海， 王 敏，张志军，等. 玉米单倍体加倍效果的研究[J]. 吉林农业科学， 2011， 36（5）：9-12.

[3] 刘治先， 张铭堂. 玉米Stock6的遗传特性及其在玉米育种上的应用[J]. 山东农业科学1996，3：4-7.

[4] Wan Y， Duncan D R，Rayburn A L， et al. The use of antimicrotubule herbicides for the production of doubled haploid plants from anther-derived maize callus[J]. Theor. Appl. Genet.， 1991， 81（2）：205-211.

[5] Jakse M， Havey M J， Bohanec B. Chromosome doubling procedures of onion （Allium cepa L.） gynogenic embryos[J]. Plant Cell Rep.， 2003， 21（9）：905-910.

[6] 惠国强，杜何为，杨小红. 不同除草剂加倍玉米单倍体的效率[J]. 作物学报，2012，38（3）：416-422.

[7] Lashermes P. Beckert M. Genetic control of maternal haploidy inmaize（Zea mays L.）and selection of haploid in ducing lines[J]. Theor. Appl. Genet.， 1988， 76（3）：405-410.

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[9] 魏俊杰，张晓丽，陈梅香，等. 6叶期秋水仙素注射处理玉米单倍体的加倍效果研究[J]. 玉米科学， 2007， 15（4）： 49-51.