人胚胎脊髓背根雪旺氏细胞的培养

[摘要] 目的 探索人胚胎雪旺氏细胞的分离、培养和纯化的方法，为将来雪旺氏细胞移植奠定基础。 方法 从胎儿脊髓背根中分离培养雪旺氏细胞，利用雪旺氏细胞与纤维母细胞的不同贴壁特性，综合利用酶消化、时间差和阿糖胞苷抑制等方法，达到分离和纯化人雪旺氏细胞的目的。 结果 雪旺氏细胞大部份呈梭形，两端有突起，少数呈多角形。 免疫组化示这些细胞呈S-100抗原阳性，细胞纯度达99%。 结论 本方法分离、培养的人雪旺氏细胞纯度高，是一种有效的培养方法。

[关键词] 雪旺氏细胞；培养；人

[中图分类号] R421 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）06（a）-0025-02

雪旺氏细胞（SCs）是周围神经系统中一种功能特殊的胶质细胞，是周围神经中神经鞘的主要组成部分。近年来发现，SCs不仅能维持周围神经正常的电生理传导功能，还在神经损伤后修复再生过程中起重要的作用[1]。研究表明[2]，SCs在周围神经损伤后的修复过程中，主要是通过分泌多种神经生长因子，维持神经元的存活；另一方面，SCs还通过产生细胞外基质、细胞黏附分子等，在神经轴突的再生过程中起支持和引导的作用。利用SCs的这种特性，将SCs作为一种支持细胞移植到中枢神经系统上，在神经系统损伤修复中发挥巨大的作用[3]。作为细胞移植前的基础工作，本实验探讨从人胚胎脊髓背根中分离、培养并纯化人SCs。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM细胞培养基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；0.125%胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）；胶原酶（Sigma公司）；Forskolin、牛脑垂体提取液（BT1，Sigma公司），阿糖胞苷（Sigma公司），D-Hanks平衡液，CO2培养箱（NAPCO公司），倒置相差显微镜（Olympus公司），35 mm一次性培养皿，多聚赖氨酸，兔抗人S-100（Neomarkers公司）；即用型SABC免疫组化试剂盒和褐色DAB显色试剂盒，均购自博士德公司；引产的28周死亡胎儿（汕头大学医学院第一附属医院妇产科提供）。

1.2 雪旺氏细胞的分离和培养

从引产的28周胎儿中分离背根神经，将背根神经在D-Hanks平衡液中切成小块，在37℃下加入胶原酶进行消化约1 h，后加入等量含10%胎牛血清、青酶素和链酶素的DMEM溶液中止消化。800 r/min离心5 min，移除上清，加入2 mL的DMEM，用火焰抛光的吸管进行吹打，将吹打后的细胞悬液用微孔大小约10 μm的滤网进行过滤，制成单细胞悬液。将单细胞悬液移入用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，置摇床上每隔10 min 摇10 s，总共摇30 s，将雪旺氏细胞与混杂在其中的成纤维母细胞进行分离。将上层的细胞悬液移入另外一个培养瓶中进行培养，原培养瓶中底部沉淀的成纤维母细胞和少量的雪旺细胞加入10 mL的DMEM进行培养，约4 h后，原培养瓶再进行震摇，将悬浮细胞移入另一培养瓶中进行培养，原培养瓶中余下的细胞大部份为成纤维母细胞。将上述方法取材、消化、纯化后的细胞悬液种植于含20%FBS的DMEM培养液中，于5%CO2，37℃条件下培养24 h后，更换成含阿糖胞苷（终浓度为5 μg/mL）和20% FBS的DMEM培养液，48 h左右更换成含有Forskolin及BT1生长促进剂的培养液，每周2～3次。待细胞长满皿底后以0.125%的胰蛋白酶-EDTA液消化1～2 min，同时镜下观察，当细胞开始皱缩后加入含血清培养液中止消化，离心（1 500 r/min，5 min），加入适量培养液，用抛光的吸管吹打，稀释后接种在预先涂布有多聚赖氨酸的35 mm培养皿中。静置5～15 min，吸出上清液，离心（1 500 r/min，5 min），加适量培养液， 用抛光的吸管吹打，均匀后重新接种于另一只预先涂布多聚赖氨酸的35 mm培养皿中，于5% CO2，37℃条件下培养。

1.3 S-100免疫组化法鉴定SCs及纯度

反复传代后，待P4代SCs长满底部后，以3%甲醛固定10 min，PBS冲洗3次。加入一抗兔抗人S-100多克隆抗体（1∶100），4℃过夜；0.1 mol/L PBS冲洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗2 min×3次；滴加试剂SABC，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗5 min×4次；DAB（用蒸馏水1 mL加试剂盒中A，B，C试剂各1滴），室温下显色5～30 min。显微镜下观察，S-100阳性细胞为SCs。细胞纯度采用抽样法进行统计。该方法大略如下：用一带网格的盖玻片在显微镜下对S100抗原阳性细胞（雪旺氏细胞）和S-100抗原阴性细胞（非雪旺氏细胞）进行细胞计数。第一个计数区域选择在盖玻片中央部位，计数后水平或垂直移动盖玻片2 mm，再进行计数，依同样的方法共计数9个区域，最后再进行统计。

2 结果

细胞悬液种植2～4 h后，倒置显微镜下观察，刚贴壁的SCs呈小而圆，折光性好，少数呈双极或三极的梭形；成纤维细胞胞体较大，形状不规则，较SCs贴壁更早，黏附更牢。24 h后大部分细胞完全贴壁，大多数细胞呈两端突起的梭形，少量呈多角形，相邻细胞之间以突起相连（图1）；在这些梭形细胞中间，夹杂一些散在分布，形状不规则，细胞个体较大的细胞，这些细胞是纤维母细胞。加用阿糖胞苷后，有少量的细胞胞体变黑浮起，细胞增殖明显受抑制，成纤维母细胞受抑制更明显。细胞生长融合延缓，第6～9天细胞才长满皿底部。经传代后SCs纯度明显提高。

免疫组织化学检测，SCs被染成黄褐色（图2），而成纤维母细胞不着色。示SCs呈S-100抗原阳性。细胞纯度统计示SCs纯度达99%。

3 讨论

有研究表明[4]，SCs能分泌20多种蛋白质，这些蛋白质的分子量分布在15～250 kD之间，这其中就包括多种神经营养因子（NTFs），这些神经营养因子中，NGF、CNTF、BDNF和FGF研究较多。有研究表明，单一的神经营养因子既能维持某些神经元的生存，又能促进其突起生长，而多种神经营养因子在一起可能有协同的生理效应，即他们可能作用于相同的受体，起协同作用。将SCs移植到中枢神经系统中，SCs能长期存活并分泌神经生长因子和细胞外基质，这将在中枢神经系统损伤中起到很重要的作用[5-6]。近年来，SCs细胞中枢神经系统移植作为支持细胞与神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤的研究很多，部分研究已经应用于临床[7-8]。因此，探索人SCs的分离、培养和纯化方法对人类有着迫切的需要。

目前SCs细胞的分离培养方法已经较为成熟，难点在于与成纤维母细胞的分离[9]。由于两种细胞的贴壁特性的不同，成纤维母细胞的贴壁时间更早，贴壁更牢固，因此，可以利用两种细胞的这种特性对其进行分离。本实验在原代培养阶段，将经过酶消化后的混悬液置于用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在摇床上进行振摇，SCs在这种条件下贴壁很少，而成纤维母细胞由于较易贴壁，大部份附着于瓶底，通过提取上清液，达到SCs与成纤维母细胞的分离。在分瓶传代过程中，利用成纤维母细胞贴壁较牢固的特性，通过调节适当的消化酶的浓度，使大部份SCs悬浮，而成纤维母细胞仍然处于贴壁状态，通过提取上清液的方法，既而与底部成纤维母细胞分离。通过不断的传代培养，使SCs不断纯化。由于阿糖胞苷对两种细胞的生长抑制程度不同，在培养液中加入阿糖胞苷，抑制成纤维母细胞的生长，使SCs的增殖速对相对于成纤维母细胞快，从而达到减少成纤维母细胞，提高SCs纯度的目的。本实验综合利用酶消化、时间差和阿糖胞苷抑制等方法分离、培养和纯化人SCs，经鉴定，这些细胞呈S-100抗原阳性，纯度达99%。本实验为将来临床利用SCs移植治疗中枢神经系统损伤奠定基础。

[参考文献]

[1] 段锴铮.外周神经再生的新机制：成纤维细胞与雪旺氏细胞的相互作用[J].生理学报，2011，63（1）：94-95.

[2] Usach V， Goitia B， Lavalle L，et al. Bone marrow mononuclear cells migrate to the demyelinated sciatic nerve and transdifferentiate into Schwann cells after nerve injury： attempt at a peripheral nervous system intrinsic repair mechanism [J]. J Neurosci Res，2011，89（8）：1203-1217.

[3] Ban DX， Ning GZ， Feng SQ， et al. Combination of activated Schwann cells with bone mesenchymal stem cells： the best cell strategy for repair after spinal cord injury in rats [J]. Regen Med， 2011，6（6）：707-720.

[4] Madduri S， Gander B. Schwann cell delivery of neurotrophic factors for peripheral nerve regeneration [J]. J Peripher Nerv Syst， 2010，15（2）：93-103.

[5] Saberi H， Firouzi M， Habibi Z， et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries： 2-year follow-up of 33 cases [J]. J Neurosurg Spine， 2011，15（5）：515-525.

[6] 朱辉，封亚平，游思维，等.人胚胎雪旺细胞脊髓内移植治疗晚期脊髓损伤[J].中华神经外科疾病研究杂志，2007，6（3）：240-243.

[7] Wang JM， Zeng YS， Wu JL， et al. Cograft of neural stem cells and Schwann cells overexpressing TrkC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transaction [J]. Biomaterials， 2011，32（30）：7454-7468.

[8] Zhang JF， Zhao FS， Wu G， et al. Therapeutic effect of co-transplantation of neuregulin 1-transfected-Schwann cells and bone marrow stromal cells on spinal cord hemisection syndrome [J]. Neurosci Lett，2011，497（2）：128-133.

[9] 何晶，李锋，丁文龙.雪旺氏细胞体外培养不同方法的比较[J].解剖学杂志，2006，29（3）：384-386.

（收稿日期：2012-02-03 本文编辑：卫轲）