胚胎干细胞范文

时间:2023-02-25 05:09:43

胚胎干细胞

胚胎干细胞范文第1篇

201314上海市第85医院儿科

1998年11月,美国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐

述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞(ESce

lls)和胚胎生殖细胞系(EGcells)[1,2]。ES细胞最引人关注的2条特征

是:ES细胞能在体外条件下生长,在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体

外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性,即发育成

成体中各种细胞的能力。

ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出

生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造

人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究,如果克隆技术可以从患

者自体组织中获得干细胞,则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束

在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基

因运载系统。总之,其前景十分广泛。

1胚胎干细胞的一般定义特征

考虑到ES或EG细胞的特性,可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的

,其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细

胞所特有,或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能

性干细胞所应具有的特征如下:(1)来源于一个全能性的细胞群体;(2)具有正常

的细胞核型;(3)具永生性,在胚胎状态下能无限制的分裂;(4)培养的细胞株在

体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织(extraembryonictissues)和分属所

有3种胚层的体细胞。但到目前为止,所有已培养成功的哺乳动物细胞中,除小鼠

外,灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义

限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因,来源

于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此,如果来源于人的细

胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义,我们就认为它属于ES细胞。需要指出的

是,要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是

十分困难的,因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中,一些组织都是十分罕见的。

2胚胎干细胞的最新研究

JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细

胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚

层去除,内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上,经过短暂的粘

附和展开的过程,将细胞重新分散(disaggregated)并转移到另外的饲细胞层,

在培养基和培养系统与方面,培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同,而且

人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们

首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠

ES细胞是不同的,特别是在外形上,且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细

胞。因此,要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的

。但还有一个重要的条件,即人胚胎培养过程的改进,其包括不同发育阶段使用不

同的培养基的两步培养系统,这使得能高效地得到高质量的人囊胚[4]。

Shamblott和同事[2]在《美国科学院论文集》上,报道从受精

5~9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的

成熟过程的小细节知之甚少,但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至

性腺并开始扩增,随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中

已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞[5]。Shamblott小组所使

用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子

,即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子(LIF)和f

orskolin[6]。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞

的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群,都能在体外培养过程中保持有正

常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次,且细胞含有端粒酶

活性,这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久,

但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个

胚层组织的畸胎瘤,且个别组织表现为高级的组织结构性(例如可以形成神经管)

。但是在体外情况下,细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成

的某些标志性分子(如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白);从生殖细胞来源的细

胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据,但是作者确实观察到了在胚状体(embry

oidbodies)中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条

件下,由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两

层,一层是胚胎外的内皮层,一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细

胞分化成多种细胞类型,这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况[2]

。Shamblott将培养出来的胚状体切片,用免疫化学方法研究,发现不同细胞类型

表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。

人的干细胞的表型,即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型

细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞,猴和人的ES细胞在表

型上十分相似,与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养

条件下呈扁平的克隆,细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长,细胞更圆,细胞

边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的

自我更新可以被白血病抑制因子(LIF)或相关的细胞因子促进[7]但对人的

ES细胞却没有这种作用[1,2]。

在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下,目前对人ES细胞的研究出现

一股热潮。如果成功,将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体

外培养的胚胎干细胞正常地分化,这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有

可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育,非正常发育(通过改

变细胞系的靶基因),新的人类基因的发现,药物筛选和致畸实验,以及作为组织

移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。

3胚胎干细胞应用前景探讨

人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的

良好条件,这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术

,比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达,可

以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制,发现新的人类基因。结合基因打靶技术,

可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选,人胚胎

干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平,极大减少了药物

实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属,其结果

常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾

病的发病机制和进展结果,从而可找到特效和永久的治疗方法。

人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官,

因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都

可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗,如用神经细胞治疗神

经变性疾病(帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等),用造血干细胞重

建造血功能,用胰岛细胞治疗糖尿病,用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对

于后2项,胚胎干细胞可能会有特别疗效,至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有

干细胞,自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应,还可以对胚胎干

细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞,因为它可以自我复

制更新,治疗基因通过它带入人体中,能够持久地发挥作用,而不象分化的细胞那

样,在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术,可

以矫正缺陷基因。例如,如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤

维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病,可以收集部分或全部胚胎干细胞,通过

基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因,再将修复后的胚胎干细胞嵌

入胚胎中,将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题,现在还未开展此

类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”,即破坏

细胞中表达组织相容性复合物的基因,躲避受者免疫系统的监视,从而达到防止免

疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因,而且这种细胞发

育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。

另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细

胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应,ES细胞的获得还有另一种方法,

即从患者自身成熟细胞中取出细胞核,移植入去核的卵细胞中(即体细胞核转移技

术SCˉNT),经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种

包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚,若将囊胚植

入假孕妇女的子宫中,将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体,即所谓的“

克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞(ES)”,

并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等,将这些细胞移植至发病部

位,则能够修复患者的组织或器官,从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养

获得的细胞、组织或器官,其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体

细胞的患者完全一致,不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实,这将是人类

医学史上一项划时代的成就,它将使器官培养专业化,全面解决供体器官来源不足

的问题;并达到器官供应专一化,提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组

织一旦出现异常,则医生可给予更换和修复。

利用核转移克隆技术以获取ES细胞,人卵子来源不足是目前的主要难题。至今

为止,非人类哺乳动物的克隆效率非常低,大约100个以上的卵细胞才能得到1个有

活力的克隆[8,9]。要解决这个问题,一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分

化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿,但这需要发展卵细胞

在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞

,这项技术基于一种假设,即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代,从而不

会形成杂种细胞。

4面对的挑战

要使上述设想变为现实,还需要对人胚胎干细胞做深入研究,还需要解决许多

技术上的因素,这些问题包括:(1)人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持

体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩

,如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化,但仍需进一步研究干细

胞的培养条件。(2)如何定向诱导干细胞分化[10]?细胞分化是多种细胞因

子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型

的组织,就需要了解各种因子在何时何地开始作用,以及何时何地停止作用。但是

科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提(祖细胞),将祖细

胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织,因为机体能够分泌所有指导细胞正

确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植,只需要将已

诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用,这些移植的细胞

与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中[11]。(3)要

使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂

的器官,这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过

程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如,肺中的肌组织、血

管和结缔组织来源于中胚层,而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄

代谢产物,分化的组织中需要产生血管,组织血管化目前还处于起步研究阶段。就

目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法

做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞

注射到重度免疫缺陷动物的脏器中,让移植的人干细胞逐步替代动物细胞,使其脏

器人源化,成为可供人体的器官移植。(4)如何克服移植后的问题?前面提到的改

变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激

活沉默基因,启动DNA的合成,会不会改变染色体的结构等等问题,还有待进一步

研究。而且,胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向,必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的

移植的安全性做一全面、客观、深入的评价,极需人们对此作更深入的研究。

5其他替代胚胎干细胞应用的技术

由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决,因此人们

正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如,根据现阶段的研究可以

认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性,那么在只有有限

分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些

早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象,例如,小鼠和大鼠卵黄囊的内

皮层细胞可以在invivo由异体分化(transdifˉferentiate)状态转变成全能性细

胞[12],将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更

新的全能性细胞[1~3]。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞(adult

stemcells)替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出

来的干细胞,能在体外长期培养,在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细

胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞,甚至在像脑、肝脏这些更新较

慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中,必须通过特定的分子标志才能将干

细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提

供重要的线索。例如,表皮干细胞表达高水平的β1-integrins,而β1-inte

grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生[13~16]

。据原先的推测,成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞,即血液干

细胞只能分化出各种血液细胞,而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一

系列研究发现说明:通过控制周围环境,成体干细胞也能够分化成多种不同类型的

细胞,表现出一定的多能性[17~20]。

Bjornson等人报道,将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后

的小鼠的循环系统中,可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞,

这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力[21]。Margaret

A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞,它能够分化成几乎所有

种类的血液细胞,而且效力比完全的骨髓成分高10~14倍[22]。此外,陆续

还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞[23];小鼠血

液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞[24];人和小鼠神经干细胞分化成骨

骼肌细胞[25];人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞[26];人体血

液干细胞转化成肝脏细胞[27];人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细

胞[28]。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系

统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出

多种细胞类型特有的相关基因的表达[29~30],以及当B淋巴细胞细胞的正常

分化由于Pax5的缺失被阻断后,B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细

胞[31]。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的

状态,在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。

以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难,必须寻找一种更容易得到,更

容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞,这种细胞可以从成

人骨髓中分离得到,能在去分化的状态下稳定复制,并能分化成多种间质组织包括

骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等[32~33]。最近,从脂肪组织中分

离出干细胞,它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织[34];另外从啮齿动物

真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞,可能

可以作为未来理想的干细胞来源[35]。但到目前为止,成体干细胞能转化的

细胞类型还十分有限,因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之,胚胎

干细胞的研究及应用,将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程,给人类带来

全新的医疗方法。随着研究的深入,许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干

细胞及其相关技术而被治愈。

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胚胎干细胞范文第2篇

美国总统奥巴马于2009年3月9日签署行政命令,宣布解除对用联邦政府资金支持胚胎干细胞研究的限制,这意味着长期制约美国胚胎干细胞研究的最后一个壁垒被打破,而此前,小布什政府一直禁止政府资金用于该项研究,奥巴马的这一决定表明在此问题上他与布什政府的彻底决裂。资金是干细胞研究的“活力源泉”

促使奥巴马发出解禁令最根本的原因是试图解决胚胎干细胞研究潜在商机的日趋加大和美国原有领先地位正在逐步丧失状态的矛盾。

自1997年英国成功克隆出世界上第一只克隆羊“多莉”以来,人类干细胞研究就成为伦理争论的热点。在1999年末的年度世界十大科技成就评选中,“干细胞研究的新发现”荣登榜首。由于干细胞研究具有巨大的医学价值,如何分离、保存并在体外人工培养干细胞,并使之成长为各种组织和器官,成为干细胞研究的首要课题。

胚胎干细胞是具有最广泛发展潜力的干细胞,从技术上称,利用胚胎干细胞培养人体组织和器官以治疗疾病是最理想的方法。美国是世界上干细胞研究最先进的国家之一,干细胞研究(从骨髓移植算起)在美国已有约40年的历电,早在1998年美国人就成功分离并培育出了多能干细胞。然而,小布什政府以不能超越道德底线为由,颁布了限制令。在美国禁止胚胎干细胞研究的联邦资助期间,世界各国的干细胞研究取得了重大进展。有鉴于此,美国科学界和公众曾多次呼吁政府改变立场,国会甚至也要求放宽联邦政府资助胚胎干细胞研究,但布什否决了国会提交的法案。由于无法得到足够的研究资金支持,越来越多的美国胚胎干细胞研究人员转向别国寻求发展,而这样做的后果可能使美国在这一研究领域失去主导地位。

此次奥巴马的解禁令意在纠正美国过去八年对胚胎干细胞研究采取的“错误路线”,得到美国科学界的高调回应。哈佛大学干细胞研究所专家乔治・戴利称,资金是干细胞研究的“活力源泉”,这一决定将使科学家们拥有更多研究工具探求疾病的起源,也将为研发新型药物奠定基础;这一新政策能够促进相关研究项目蓬勃发展,使美国尽快在这一领域取得领先地位。康涅狄格大学再生生物学中心主任戴维・戈登海默认为,对于提高美国的干细胞研究水平来说,解除针对联邦政府资助的有关限制是基础性的一步。

解禁令为奥巴马政府确保领先开了个头,加强美国在科技和创新领域的主导地位将被纳入奥巴马政府的中心要务。奥巴马承诺将今后10年基础研究的经费翻一番,增加对实证科学、生命科学、数学和工程学领域基础研究的资助。

“政治归政治,科学归科学”

实现科学与政治的分离是奥巴马的竞选承诺。在为自己的立场辩护时他一直强调,政府的决策应该基于最可行且具有科学有效性的证据,而不是某些官员的意识形态偏见。这意味着奥巴马要在政治与科学之间划一条明确的界限,使他的政府能实现“政治归政治,科学归科学”的理想。

有媒体称,布什可以借伦理争议限制科学,而奥巴马则可以借科学和人类福祉的名义推动科学。事实上,布什和奥巴马仅仅只是代表,体现的是个人价值观和社会政治倾向的差异。

布什相信科学研究要促进国家利益,要避免道德争端,他有责任以政府的权威和信用来维护国家利益、充当道德裁判,因此,他反对联邦政府对人类胚胎干细胞研究提供支持。类似的情况也反映在他执政时期的其他领域,如在气候变化等问题上用意识形态或政治取代科学。美国一机构去年4月份的一项调查显示,在美国环境保护署工作的科学家中,超过半数的人承认他们在进行科研时曾受到有关部门的政治干预,半数的人认为这种干预行为是“经常性或随时存在的”。

奥巴马的解禁令被一些媒体解读为对其前任政治干预科学做法的一记重拳,它旨在恢复政府决策中的“科学诚信”,允许科学家在“不受操纵和强迫的情况下”工作。密歇根大学干细胞生物学中心主任肖恩・莫里森称,这是美国科学领域的一大进展,奥巴马的举动表明“科学政策应建立在科学基础之上”。

尽管人们把解禁令提升到“健全科学”的高度,但奥巴马要在当今的美国社会真正实现“政治归政治,科学归科学”是很困难的。大科学时代,科学研究需要为国家利益服务,因而必须服从国家战略。原因很明确,现代科学研究需要大量的经费支持,类似胚胎干细胞研究这样的重要项目尤其需要政府的资助。然而,政府资金的投入要有明确的回报要求,而如何预测高效、安全的回报是政府需要考虑的事情。在决策中起重要作用的不仅是科学研究活动本身,经济、政治、宗教、道德等因素也必须纳入考虑范畴。在这种意义上,小布什的政策也不无道理。

人类胚胎是人吗

布什在总统任期内曾不顾科学界的呼吁,强硬否决了国会提案。他一直认为,从胚胎中提取干细胞无异于“故意摧毁人类胚胎”,这是他本人“不能跨越的道德底线”,也代表了美国相当一部分人的观点。奥巴马的解禁令以行政的方式终结了科学证据与道德价值观之间的“两难选择”,但它对美国的正统价值与道德观念提出了最严峻的挑战,其中最重要的问题是人类胚胎是否是人。

由于目前胚胎干细胞研究需从人体胚胎中提取胚胎干细胞,因此反对者认为,人类胚胎是人,不应因科研而失去生命。美国国会众议院共和党领袖约翰・博纳就曾说过:“纳税人的钱不应用于帮助毁灭无辜生命。”布什政府便是以捍卫人类生命为由限制这种研究的。如果胚胎是人,那么,胚胎干细胞研究进展就陷入道德困境,因为它仅仅把制造和使用人类胚胎当作实现另外目的的手段,这在伦理范畴是不道德的行为。此外,从宗教和维护生命权利的角度来讲,为从事研究而摧毁人类胚胎也是不道德的。然而,有科学家试图将人类体细胞(如皮肤细胞)改造成胚胎干细胞,这样就绕开了伦理争议。

胚胎干细胞研究的另一个道德争议是胚胎干细胞的研究无法避免克隆人的出现。对于这一问题,奥巴马表态说,新政令不会允许产生克隆人,“我们将确保政府决不开启克隆技术用于‘复制’人体之门”,“它不仅危险,而且严重错误,在我们的社会或任何一个社会都没有立足之地”,他相信只要明确规范和严格监管,危险就能够避免。

需要指出的是,将美国反对胚胎干细胞研究完全归罪于布什是不恰当的。早在20世纪70年代,美国就禁止对人体胚胎的研究,胚胎干细胞研究也在被禁之列。不过,所谓禁止,只是不允许联邦政府的资金资助这类研究,并不禁止私人资助。另外,奥巴马的解禁令能否在短期内给美国胚胎干细胞研究带来显著改观还存疑问。因为,这一政策转变成具体的方案还需要多方面的工作,如制定美国人类胚胎干细胞研究的伦理规范,确定联邦政府资金何时以及通过何种方式资助相关研究;修订美国现有禁止用联邦政府资金制造人类胚胎干细胞的法律等。

胚胎干细胞范文第3篇

[关键词] 环孢霉素;胚胎干细胞;细胞分化;心肌细胞

[中图分类号] R329.2+8[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)05(b)-021-02

Cyclosporin-A induces differentiation of cardiocytes from embryonic stem cells

YAN Peishi

(Department of Cardiology, Dalian Central Hospital, Dalian 116000, China)

[Abstract] Objective: To observe the role of cyclosporin-A (CSA) in differentiation of cardiocytes from embryonic stem cells (ESCs). Methods: The differentiation rates of cardiocytes from ESCs with or without CSA induction were observed. The expression of cardiocyte markers were evaluated with immunohistochemistry. Results: Compared with those of spontaneous differentiation, the differentiation rates of cardiocytes were significantly higher in the presence of CSA. CSA-induced cardiocytes showed the specific features of cardiocytes. Conclusion: CSA potently induces cardiocytes derived from ESCs.

[Key words] Cyclosporin-A; Embryonic stem cells; Cell differentiation; Cardiocytes

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)研究已经为再生医学带来了众多的希望和选择[1-2]。许多干细胞研究已表明ESCs可成功诱导出心肌细胞,而且移植到体内可形成心肌组织[3],但目前尚没有非常有效的诱导ESCs向心肌细胞分化的方法。

有研究报道了一个新的体外分化心肌细胞系统[4-5],避免了EB的形成,是一个二维细胞培养系统。Flk1是内皮生长因子的受体之一,是最早形成的内皮细胞和血细胞的表面标志物,也是中胚层干细胞的标志物。这个分化系统中,代表3个不同分化阶段的ES细胞是逐步诱导的,它们是未分化的ES细胞,Flk1+的中胚层干细胞和心肌细胞。第一步诱导ESCs生成Flk1阳性细胞,用流式细胞仪(FACS)分离提纯,再继续在OP9饲养层细胞上分化培养Flk1阳性细胞。在Flk1细胞分化的第4天,可出现自主搏动的心肌细胞。

笔者在进行细胞移植实验时,将分离纯化的心肌细胞注射到服用环孢霉素A(CSA)的小鼠体内,作为对照实验,在体外探讨了CSA对心肌细胞分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

高糖DMEM培养液,青/链霉素双抗,非必需氨基酸,β巯基乙醇,L谷氨酰胺,胰蛋白酶,胎牛血清,白血病抑制因子(LIF),明胶,丝裂霉素C,CSA(由诺华药品公司赠送)加入二甲基亚砜溶解为30 mg/ml。用分化培养基在用时稀释成1~3 μg/ml。小鼠抗心肌肌小节(α-actinin)、肌钙蛋白T(cTnT)抗体、Alexander546标记的兔抗鼠荧光抗体、鼠Flk1(AVAS12)单克隆抗体购自NeoMarkers。

1.2 方法

1.2.1 小鼠ESCs的培养及分化EMG7胚胎干细胞株由日本京都大学山下润副教授馈赠。该细胞株导入了αMHC启动子控制的GFP基因,当自主搏动的心肌细胞出现时,在荧光显微镜下可观察到心肌细胞的绿色荧光。

ESCs复苏后接种到明胶覆盖的培养皿上,加入ESCs培养基,于37℃、5% CO2孵箱中培养,隔天传代。ESCs培养基为含有非必须氨基酸(0.1 mmol/L)、青霉素(50 U/mL)、链霉素(50 μg/L)、β巯基乙醇(0.1 mmol/L)、LIF(1×106 U/ml)、胎牛血清(15% V/V)的DMEM。将传代2~3次的ESCs消化,离心后加入分化培养基,分化培养基为含有青/链霉素双抗及胎牛血清(20% V/V)的DMEM。每48小时更换分化液,第4.5天(108 h)时用FACS分离提纯Flk1阳性细胞,继续在OP9饲养层细胞上培养4 d,自主搏动的心肌细胞可出现,第6天可以用FACS分离提纯GFP阳性的心肌细胞。单纯加分化培养基的设为对照组(n=5),即自发分化组;分化培养基中加入CSA(n=5),即诱导分化组,在Flk1阳性细胞接种到OP9细胞上时加入CSA。

1.2.2 OP-9细胞的准备 取3~5代的OP9,加入终浓度为10 μg/ml的丝裂霉素C处理2 h,PBS洗涤2次,消化、离心,接种到10 cm的培养皿中制成饲养单层细胞。

1.2.3 FACS分离提纯细胞经过96~108 h分化,把细胞从培养皿上消化并收集起来,与APC-Flk1抗体结合,标记上DAPI,用FACS-Vantage分离提纯Flk1阳性细胞,继续在OP9细胞上培养6 d。

1.2.4 细胞免疫荧光检测吸掉24孔培养皿中的培养液,室温下4%多聚甲醛固定15 min,冷PBS洗涤2次,加1% BSA室温下封闭30 min。加入cTnT抗体(1∶2 000稀释)及α-actinin(1∶200稀释)4℃孵育过夜。第2天PBS洗涤后加入Alexander546标记的兔抗鼠抗体(1∶200稀释),室温下孵育1 h;PBS洗涤后复染0.1 μg/ml DAPI,荧光显微镜下观察。

1.2.5 定量分析心肌细胞的分化率cTnT荧光染色后,使用电子CCD相机探测cTnT的荧光强度,然后用Image-Pro Plus图像处理软件处理数据。

1.3 统计学处理

经SPSS 11.5软件分析,组间比较采用方差分析,P

2 结果

2.1 CSA对ESCs的诱导作用

数据以均数±标准差(x±s)表示,CSA能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞。加入CSA显著增加了自主搏动的心肌细胞(图1A);对照组cTnT阳性心肌细胞为(1.00±0.05),CSA组为(13.00±0.08),CSA组比对照组增加了13倍(P

图1CSA诱导并扩增ESCs分化形成心肌细胞

(A.cTnT-HRP染色后显示CSA诱导的cTnT阳性心肌细胞增多;B.用cTnT免疫荧光染色后,定量评估心肌细胞分化率)

Fig.1Cardiocyte induction from ESCs by CSA

(A.CSA-induced cTnT positive cardiocyte increased after cTnT-HRP staining; B.Quantitative evaluation of cardiocyte induction by fluorescent intensity of cTnT staining)

2.2 细胞免疫荧光检测

细胞免疫荧光检测显示,CSA诱导生成的心肌细胞可正常表达cTnT(图2A)和心肌肌小节α-actinin(图2B、C)说明肌浆网形成。

以上结果表明CSA成功诱导了ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞。

3 讨论

心肌细胞是终末分化细胞。当心肌细胞发生缺血、坏死后,心肌组织发生重构,有效心肌数目减少,心脏功能发生不可逆减退,导致心力衰竭[6]。ESCs是具有自我更新能力和多向分化潜能的全能干细胞,是心肌细胞再生的理想供体细胞,但目前胚胎干细胞向心肌细胞分化的阳性率很低[7]。

本研究提供了一种新的方法来诱导和扩增胚胎干细胞向心肌细胞分化。CSA是一种calcineurin拮抗剂,能够阻断T细胞内的NFAT的信息通路,从而发挥免疫抑制剂的作用[8]。CSA还参与了各种各样的细胞活动[9],如心脏瓣膜的形成[10]、心肌肥厚[11]和毛发的生长[12]。CSA可能经NFAT信息通路参与心肌细胞的分化,但目前具体的作用机制还不明确,有待进一步研究。

[参考文献]

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[12]Horsley AO, Aliprantis L, Polak LH, et al. NF -ATc1 balances quiescence and proliferation of skin stem cells [J]. Cell,2008,115(2):299-310.

胚胎干细胞范文第4篇

那么,有没有可能制造出单倍体胚胎干细胞呢?科学家们想出了非常巧妙的办法。他们把注射到去除了细胞核的卵母细胞中,或者把原核期受精卵的雌原核去除,再把这样的细胞体外培养到囊胚期,由此能获得“孤雄单倍体胚胎干细胞”。类似地,去除原核期受精卵的雄原核,或者孤雌激活卵母细胞,再将细胞体外培养至囊胚,则能获得“孤雌单倍体胚胎干细胞”。经检测验证,这些单倍体干细胞既保持了普通胚胎干细胞的特点,又同或卵细胞一样只有一套染色体,而不是像普通二倍体胚胎干细胞那样有两套。

获得基因修饰动物

为了检测单倍体胚胎干细胞的功能,科学家们将孤雄单倍体干细胞注射到卵母细胞中,惊奇地发现,它能够成功替代完成使卵受精的使命,所得胚胎能正常发育至成年并具有生育能力。进一步,科学家们对这种孤雄单倍体胚胎干细胞进行了特定的基因修饰,并注射进卵母细胞得到后代,这样出生的小鼠直接携带了这种修饰后的基因序列,从而方便地获得了基因修饰动物。利用单倍体胚胎干细胞获得基因修饰动物,为一些其胚胎干细胞不能嵌合到生殖系的物种,例如非人灵长类等,提供了新型的获得基因修饰动物模型的方法。

进行同性生殖

由于在哺乳动物中进化出了基因组印记调控,哺乳动物无法实现同性生殖。而利用单倍体胚胎干细胞技术,小鼠的同性生殖已经成为了现实。科学家们利用新型的基因编辑技术CRISPR-Cas9系统改变了孤雌单倍体干细胞中称为H19和Gtl2的两个非常重要的印记基因区域,将原本的雌性印记逆转为了雄性印记。然后将这种逆转后的孤雌单倍体干细胞替代,注射进卵母细胞,获得了遗传物质来自于两个雌性亲本的后代小鼠。这一技术将加速人们对于基因组印记机制的研究,也会给生殖方式带来新的认知。

研究物种间杂交

物种之间存在生殖隔离,一直以来,科学家都想获得分别来源于两个物种全套遗传物质的稳定细胞系。而最近,科学家利用单倍体干细胞技术,将这一想法变为现实。他们将大鼠和小鼠的单倍体胚胎干细胞进行细胞融合,创造出了大小鼠异种杂合二倍体胚胎干细胞,这种细胞含有一套大鼠染色体和一套小鼠染色体。他们通过测序方法统计出大部分基因的表达量是小鼠和大鼠各贡献一半。这一研究建立了新型的哺乳动物胚胎干细胞,为研究物种间性状差异,物种间基因、RNA和蛋白质之间相互作用提供了非常好的工具。

展望

胚胎干细胞范文第5篇

【摘要】有人曾说每个女人都拥有两个花园:脸和卵巢。脸是表面花园,卵巢则是秘密花园。

卵巢是女性内分泌腺体的重要组成部分,卵巢以韧带与子宫相连,位于盆腔内子宫的两侧。卵巢对于女性来说非常重要,它的主要功能有分泌雌激素、孕激素以及产生卵子,调节机体的生理功能,以使女性的内分泌系统维持平衡。

【关键词】 胚胎干细胞;卵巢;内分泌;激素

1 卵巢及其对于女性的影响

卵巢位于子宫底的后外侧,与盆腔侧壁相接,表面布满血管,内部含有黄色的卵泡,是女性重要的的性腺器官,掌管着女性生殖与内分泌两大重要功能,负责排卵和分泌重要的女性激素。卵巢对女性身上的400多个器官的功能都有影响,在女性的一生中,卵巢起着至关重要的作用。

卵巢所分泌的雌孕激素与女性体内三百多个激素受体密切相关,卵巢的健康状况与女性的年轻态息息相关,是女人延缓衰老和保持健康的关键因素。内分泌系统的功能趋于平衡的人通常会比同龄女性看起来更年轻。

在女性的各个年龄阶段,卵巢的大小与功能都在不断变化着。女性卵巢的功能最为旺盛的时期一般是在性成熟期,此时卵巢整体形状呈扁橄榄形。当女性步入更年期之后,卵巢逐渐开始萎缩,皮质中的卵泡数目也随之日渐减少,不能再正常发育并最终消失。当卵巢不再排卵、不再分泌雌、孕激素时,人也就步入了衰老期。

卵巢的激素分泌与体内其它各种分泌腺也相互关联、相互影响着,如甲状腺、肾上腺等体内其它内分泌腺的功能失调时,或者如糖尿病等代谢性疾病也会给卵巢的正常功能带来影响,导致卵巢的激素分泌、排卵或黄体形成发生异常,给女性的身体健康带来危害。

女性卵巢功能下降会给女性带来以下影响:

(1)对皮肤的影响:

卵巢功能下降会导致女性的肌肤干燥、黯淡无光,使皮肤表面出现皱纹及暗疮、色斑,还会导致皮脂腺分泌失衡,毛孔粗大。

(2)对身体的影响:

① 体型剧变,身材走样,比如诸多部位脂肪堆积,导致局部肥胖;

② 胸部脂肪流向手臂、背部以及两肋,导致下垂外扩、松弛萎缩无弹性;

③ 引起内分泌紊乱、失调,出现更年期提前等不良现象;

④ 还会导致腰酸腿痛以及一系列的妇科炎症等;

⑤ 卵巢功能调节障碍甚至会导致女性不孕。

(3)对精神方面的影响:

卵巢功能下降对女性精神方面的影响也是不可忽略的。通常会使人失眠、不安、异常潮热、情绪波动较大、烦燥、忧虑,不自信等。

据有关研究表明,对于年轻的女性来讲,雌激素每减少10%,皮肤衰老的速度就会加快13%,而当雌激素降低至50%左右的时候,也就是到了每个女性必经的生理过程――更年期。一般情况下女性在60岁的时候,雌激素的分泌数量仅仅是年轻时的10%,即使不缺钙,也使女性患上腰膝酸软等骨质疏松症的可能性大大增加。因此,女性维护好卵巢的功能,是保持健康与青春的重要前提。

2 胚胎干细胞移植及其对女性卵巢的作用

2.1 胚胎干细胞、胚胎干细胞移植

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs,简称ES或EK细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺种分离出来的一类细胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境,ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

著名生物学家EB Wilson曾经说过“所有生物学的答案最终都要到细胞中去寻找,因为所有生物体都是或曾经是一个细胞”。细胞治疗是将正常的干细胞植入病变部位代偿病变细胞丧失的功能。许多疾病都是细胞缺陷或器官损伤造成的,胚胎干细胞提供了可供移植的细胞,可分化产生人体内230多种功能细胞。

胚胎干细胞可预防和治疗多种疾病,专家介绍说,胚胎干细胞移植能够从本质上抑制衰老的发生,有效延长生命,在细胞水平上预防和治疗各种疾病。这是传统医学所无法企及的。

胚胎干细胞移植就是将胚胎干细胞作为种子细胞移植到身体中,受机体调控,按照生命的需求逐步分化形成各组织器官所需要的功能细胞,替换身体当中累积的衰老、病变细胞,加快细胞新旧更新速率,恢复并维护各组织器官生理功能,使人体重新回到年轻、健康状态。

胚胎干细胞移植从根本上预防和治疗多种疾病。疾病是细胞病变的综合反映,衰老细胞是多种疾病发病的基础,而移植胚胎干细胞可以增加机体年轻、健康细胞的数量,替换衰老细胞,预防各种疾病的发生。

2.2 移植胚胎干细胞对女性卵巢的作用

移植的胚胎干细胞随着血液循环迁移到卵巢,随之分化产生足量的新生卵巢细胞,补充卵巢细胞数量,维持卵巢的正常形态,从而防止卵巢萎缩变形。另外,新生的卵巢细胞可以对脑垂体分泌的促性腺激素作出及时、正确的反应,分泌足量的雌性激素,使体内激素水平处于平衡状态。移植干细胞,可以改善女性因为卵巢功能衰退而带来的各种困扰,消除更年期的各种不适症状,使提前绝经或正常绝经不久的女性恢复月经,推迟更年期,从而起到抑制衰老、延长青春的作用,使女性朋友重获青春、健康之美。

总之,女性的卵巢是女性身体健康状况的晴雨表,胚胎干细胞移植技术的成熟无疑是女性的福音。胚胎干细胞移植给卵巢带来的积极影响是不可估量的。但要维持卵巢功能的正常,还是要靠平时生活中的呵护。平常注意保持心情舒畅;合理安排生活节奏,保证充足的睡眠时间,避免过度劳累;保持均衡的营养;经常锻炼身体,促进体内血液循环,防止积劳成疾;注意在公共场所、家庭减少被动吸烟。

参考文献

[1] 田雪梅 刘娜 陆敏 胚胎干细胞移植治疗帕金森病《细胞 生物学杂志》 2008年01期

[2] 王树玉 张军 任国庆 胚胎干细胞的研究进展[A];第五届 全国优生科学大会论文汇编[C];2000年

[3] 印惠 胚胎干细胞――人类的新希望[A];中国生物工程学 会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集 [C];2001年

作者简介:丁祥云,女,1980年生,山东临沂人,现工作单位山东医学高等专科学校,2005年毕业于锦州医学院,今就读于山东大学在职研究生

胚胎干细胞范文第6篇

1998年11月,美国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐 述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞(ESce lls)和胚胎生殖细胞系(EGcells)[1,2]。ES细胞最引人关注的2条特征 是:ES细胞能在体外条件下生长,在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体 外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性,即发育成 成体中各种细胞的能力。

ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出 生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造 人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究,如果克隆技术可以从患 者自体组织中获得干细胞,则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束 在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基 因运载系统。总之,其前景十分广泛。

1胚胎干细胞的一般定义特征

考虑到ES或EG细胞的特性,可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的 ,其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细 胞所特有,或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能 性干细胞所应具有的特征如下:(1)来源于一个全能性的细胞群体;(2)具有正常 的细胞核型;(3)具永生性,在胚胎状态下能无限制的分裂;(4)培养的细胞株在 体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织(extraembryonictissues)和分属所 有3种胚层的体细胞。但到目前为止,所有已培养成功的哺乳动物细胞中,除小鼠 外,灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义 限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因,来源 于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此,如果来源于人的细 胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义,我们就认为它属于ES细胞。需要指出的 是,要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是 十分困难的,因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中,一些组织都是十分罕见的。

2胚胎干细胞的最新研究

JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细 胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚 层去除,内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上,经过短暂的粘 附和展开的过程,将细胞重新分散(disaggregated)并转移到另外的饲细胞层, 在培养基和培养系统与方面,培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同,而且 人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们 首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠 ES细胞是不同的,特别是在外形上,且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细 胞。因此,要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的 。但还有一个重要的条件,即人胚胎培养过程的改进,其包括不同发育阶段使用不 同的培养基的两步培养系统,这使得能高效地得到高质量的人囊胚[4]。

Shamblott和同事[2]在《美国科学院论文集》上,报道从受精 5~9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的 成熟过程的小细节知之甚少,但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至 性腺并开始扩增,随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中 已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞[5]。Shamblott小组所使 用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子 ,即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子(LIF)和f orskolin[6]。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞 的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群,都能在体外培养过程中保持有正 常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次,且细胞含有端粒酶 活性,这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久, 但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个 胚层组织的畸胎瘤,且个别组织表现为高级的组织结构性(例如可以形成神经管) 。但是在体外情况下,细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成 的某些标志性分子(如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白);从生殖细胞来源的细 胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据,但是作者确实观察到了在胚状体(embry oidbodies)中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条 件下,由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两 层,一层是胚胎外的内皮层,一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细 胞分化成多种细胞类型,这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况[2] 。Shamblott将培养出来的胚状体切片,用免疫化学方法研究,发现不同细胞类型 表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。

人的干细胞的表型,即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型 细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞,猴和人的ES细胞在表 型上十分相似,与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养 条件下呈扁平的克隆,细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长,细胞更圆,细胞 边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的 自我更新可以被白血病抑制因子(LIF)或相关的细胞因子促进[7]但对人的 ES细胞却没有这种作用[1,2]。

在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下,目前对人ES细胞的研究出现 一股热潮。如果成功,将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体 外培养的胚胎干细胞正常地分化,这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有 可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育,非正常发育(通过改 变细胞系的靶基因),新的人类基因的发现,药物筛选和致畸实验,以及作为组织 移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。

3胚胎干细胞应用前景探讨

人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的 良好条件,这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术 ,比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达,可 以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制,发现新的人类基因。结合基因打靶技术, 可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选,人胚胎 干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平,极大减少了药物 实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属,其结果 常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾 病的发病机制和进展结果,从而可找到特效和永久的治疗方法。

人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官, 因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都 可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗,如用神经细胞治疗神 经变性疾病(帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等),用造血干细胞重 建造血功能,用胰岛细胞治疗糖尿病,用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对 于后2项,胚胎干细胞可能会有特别疗效,至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有 干细胞,自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应,还可以对胚胎干 细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞,因为它可以自我复 制更新,治疗基因通过它带入人体中,能够持久地发挥作用,而不象分化的细胞那 样,在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术,可 以矫正缺陷基因。例如,如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤 维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病,可以收集部分或全部胚胎干细胞,通过 基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因,再将修复后的胚胎干细胞嵌 入胚胎中,将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题,现在还未开展此 类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”,即破坏 细胞中表达组织相容性复合物的基因,躲避受者免疫系统的监视,从而达到防止免 疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因,而且这种细胞发 育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。

另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细 胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应,ES细胞的获得还有另一种方法, 即从患者自身成熟细胞中取出细胞核,移植入去核的卵细胞中(即体细胞核转移技 术SCˉNT),经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种 包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚,若将囊胚植 入假孕妇女的子宫中,将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体,即所谓的“ 克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞(ES)”, 并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等,将这些细胞移植至发病部 位,则能够修复患者的组织或器官,从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养 获得的细胞、组织或器官,其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体 细胞的患者完全一致,不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实,这将是人类 医学史上一项划时代的成就,它将使器官培养专业化,全面解决供体器官来源不足 的问题;并达到器官供应专一化,提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组 织一旦出现异常,则医生可给予更换和修复。

利用核转移克隆技术以获取ES细胞,人卵子来源不足是目前的主要难题。至今 为止,非人类哺乳动物的克隆效率非常低,大约100个以上的卵细胞才能得到1个有 活力的克隆[8,9]。要解决这个问题,一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分 化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿,但这需要发展卵细胞 在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞 ,这项技术基于一种假设,即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代,从而不 会形成杂种细胞。

4面对的挑战

要使上述设想变为现实,还需要对人胚胎干细胞做深入研究,还需要解决许多 技术上的因素,这些问题包括:(1)人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持 体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩 ,如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化,但仍需进一步研究干细 胞的培养条件。(2)如何定向诱导干细胞分化[10]?细胞分化是多种细胞因 子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型 的组织,就需要了解各种因子在何时何地开始作用,以及何时何地停止作用。但是 科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提(祖细胞),将祖细 胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织,因为机体能够分泌所有指导细胞正 确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植,只需要将已 诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用,这些移植的细胞 与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中[11]。(3)要 使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂 的器官,这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过 程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如,肺中的肌组织、血 管和结缔组织来源于中胚层,而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄 代谢产物,分化的组织中需要产生血管,组织血管化目前还处于起步研究阶段。就 目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法 做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞 注射到重度免疫缺陷动物的脏器中,让移植的人干细胞逐步替代动物细胞,使其脏 器人源化,成为可供人体的器官移植。(4)如何克服移植后的问题?前面提到的改 变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激 活沉默基因,启动DNA的合成,会不会改变染色体的结构等等问题,还有待进一步 研究。而且,胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向,必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的 移植的安全性做一全面、客观、深入的评价,极需人们对此作更深入的研究。

5其他替代胚胎干细胞应用的技术

由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决,因此人们

正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如,根据现阶段的研究可以

认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性,那么在只有有限

分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些

早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象,例如,小鼠和大鼠卵黄囊的内

皮层细胞可以在invivo由异体分化(transdifˉferentiate)状态转变成全能性细

胞[12],将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更

新的全能性细胞[1~3]。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞(adult

stemcells)替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出

来的干细胞,能在体外长期培养,在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细

胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞,甚至在像脑、肝脏这些更新较

慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中,必须通过特定的分子标志才能将干

细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提

供重要的线索。例如,表皮干细胞表达高水平的β1-integrins,而β1-inte

grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生[13~16]

。据原先的推测,成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞,即血液干

细胞只能分化出各种血液细胞,而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一

系列研究发现说明:通过控制周围环境,成体干细胞也能够分化成多种不同类型的

细胞,表现出一定的多能性[17~20]。

Bjornson等人报道,将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后

的小鼠的循环系统中,可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞,

这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力[21]。Margaret

A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞,它能够分化成几乎所有

种类的血液细胞,而且效力比完全的骨髓成分高10~14倍[22]。此外,陆续

还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞[23];小鼠血

液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞[24];人和小鼠神经干细胞分化成骨

骼肌细胞[25];人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞[26];人体血

液干细胞转化成肝脏细胞[27];人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细

胞[28]。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系

统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出

多种细胞类型特有的相关基因的表达[29~30],以及当B淋巴细胞细胞的正常

分化由于Pax5的缺失被阻断后,B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细

胞[31]。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的

状态,在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。

以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难,必须寻找一种更容易得到,更

容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞,这种细胞可以从成

人骨髓中分离得到,能在去分化的状态下稳定复制,并能分化成多种间质组织包括

骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等[32~33]。最近,从脂肪组织中分

离出干细胞,它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织[34];另外从啮齿动物

真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞,可能

可以作为未来理想的干细胞来源[35]。但到目前为止,成体干细胞能转化的

细胞类型还十分有限,因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之,胚胎

干细胞的研究及应用,将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程,给人类带来

全新的医疗方法。随着研究的深入,许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干

细胞及其相关技术而被治愈。

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35TomaJG,AkhavanMFemandesKJ,etal.Isolationofmultipotent

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胚胎干细胞范文第7篇

健康网讯:

吕广秀 201314上海市第85医院儿科  1998年11月,美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞(ES cells)和胚胎生殖细胞系(EG cells) [1,2] 。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长,在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性,即发育成成体中各种细胞的能力。

ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究,如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞,则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之,其前景十分广泛。

1 胚胎干细胞的一般定义特征

考虑到ES或EG细胞的特性,可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的,其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有,或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:(1)来源于一个全能性的细胞群体;(2)具有正常的细胞核型;(3)具永生性,在胚胎状态下能无限制的分裂;(4)培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织(extraembryonic tissues)和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止,所有已培养成功的哺乳动物细胞中,除小鼠外,灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因,来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此,如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义,我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是,要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的,因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中,一些组织都是十分罕见的。

2 胚胎干细胞的最新研究

James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚层去除,内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上,经过短暂的粘附和展开的过程,将细胞重新分散(disaggregated)并转移到另外的饲细胞层,在培养基和培养系统与方面,培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同,而且人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠ES细胞是不同的,特别是在外形上,且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细胞。因此,要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的。但还有一个重要的条件,即人胚胎培养过程的改进,其包括不同发育阶段使用不同的培养基的两步培养系统,这使得能高效地得到高质量的人囊胚 [4] 。

Shamblott和同事 [2] 在《美国科学院论文集》上,报道从受精5~9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的成熟过程的小细节知之甚少,但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至性腺并开始扩增,随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞 [5] 。Shamblott小组所使用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子,即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子(LIF)和forskolin [6] 。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群,都能在体外培养过程中保持有正常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次,且细胞含有端粒酶活性,这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久,但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个胚层组织的畸胎瘤,且个别组织表现为高级的组织结构性(例如可以形成神经管)。但是在体外情况下,细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成的某些标志性分子(如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白);从生殖细胞来源的细胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据,但是作者确实观察到了在胚状体(embryoid bodies)中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条件下,由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两层,一层是胚胎外的内皮层,一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细胞分化成多种细胞类型,这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况 [2] 。Shamblott将培养出来的胚状体切片,用免疫化学方法研究,发现不同细胞类型表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。

人的干细胞的表型,即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞,猴和人的ES细胞在表型上十分相似,与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养条件下呈扁平的克隆,细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长,细胞更圆,细胞边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的自我更新可以被白血病抑制因子(LIF)或相关的细胞因子促进 [7] 但对人的ES细胞却没有这种作用 [1,2] 。

在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下,目前对人ES细胞的研究出现一股热潮。如果成功,将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体外培养的胚胎干细胞正常地分化,这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育,非正常发育(通过改变细胞系的靶基因),新的人类基因的发现,药物筛选和致畸实验,以及作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。

3 胚胎干细胞应用前景探讨

人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的良好条件,这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因 芯片等技术,比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达,可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制,发现新的人类基因。结合基因打靶技术,可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选,人胚胎干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平,极大减少了药物实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属,其结果常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发病机制和进展结果,从而可找到特效和永久的治疗方法。

人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官,因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗,如用神经细胞治疗神经变性疾病(帕金森综合征、

亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等),用造血干细胞重建造血功能,用胰岛细胞治疗糖尿病,用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对于后2项,胚胎干细胞可能会有特别疗效,至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有干细胞,自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应,还可以对胚胎干细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞,因为它可以自我复制更新,治疗基因通过它带入人体中,能够持久地发挥作用,而不象分化的细胞那样,在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术,可以矫正缺陷基因。例如,如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病,可以收集部分或全部胚胎干细胞,通过基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因,再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中,将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题,现在还未开展此类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”,即破坏细胞中表达组织相容性复合物的基因,躲避受者免疫系统的监视,从而达到防止免疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因,而且这种细胞发育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。

另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应,ES细胞的获得还有另一种方法,即从患者自身成熟细胞中取出细胞核,移植入去核的卵细胞中(即体细胞核转移技术SCˉNT),经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚,若将囊胚植入假孕妇女的子宫中,将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体,即所谓的“克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞(ES)”,并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等,将这些细胞移植至发病部位,则能够修复患者的组织或器官,从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养获得的细胞、组织或器官,其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体细胞的患者完全一致,不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实,这将是人类医学史上一项划时代的成就,它将使器官培养专业化,全面解决供体器官来源不足的问题;并达到器官供应专一化,提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组织一旦出现异常,则医生可给予更换和修复。

利用核转移克隆技术以获取ES细胞,人卵子来源不足是目前的主要难题。至今为止,非人类哺乳动物的克隆效率非常低,大约100个以上的卵细胞才能得到1个有活力的克隆 [8,9] 。要解决这个问题,一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿,但这需要发展卵细胞在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞,这项技术基于一种假设,即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代,从而不会形成杂种细胞。

4 面对的挑战

要使上述设想变为现实,还需要对人胚胎干细胞做深入研究,还需要解决许多技术上的因素,这些问题包括:(1)人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩,如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化,但仍需进一步研究干细胞的培养条件。(2)如何定向诱导干细胞分化 [10] ?细胞分化是多种细胞因子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型的组织,就需要了解各种因子在何时何地开始作用,以及何时何地停止作用。但是科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提(祖细胞),将祖细胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织,因为机体能够分泌所有指导细胞正确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植,只需要将已诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用,这些移植的细胞与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中 [11] 。(3)要使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官,这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如,肺中的肌组织、血管和结缔组织来源于中胚层,而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄代谢产物,分化的组织中需要产生血管,组织血管化目前还处于起步研究阶段。就目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞注射到重度免疫缺陷动物的脏器中,让移植的人干细胞逐步替代动物细胞,使其脏器人源化,成为可供人体的器官移植。(4)如何克服移植后的问题?前面提到的改变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激活沉默基因,启动DNA的合成,会不会改变染色体的结构等等问题,还有待进一步研究。而且,胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向,必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性做一全面、客观、深入的评价,极需人们对此作更深入的研究。

5 其他替代胚胎干细胞应用的技术

由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决,因此人们正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如,根据现阶段的研究可以认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性,那么在只有有限分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象,例如,小鼠和大鼠卵黄囊的内皮层细胞可以在invivo由异体分化(transdifˉferentiate)状态转变成全能性细胞 [12] ,将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更新的全能性细胞 [1~3] 。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞(adult stem cells)替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出来的干细胞,能在体外长期培养,在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞,甚至在像脑、肝脏这些更新较慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中,必须通过特定的分子标志才能将干细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提供重要的线索。例如,表皮干细胞表达高水平的β 1 -integrins,而β 1 -integrins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生 [13~16] 。据原先的推测,成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞,即血液干细胞只能分化出各种血液细胞,而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一系列研究发现说明:通过控制周围环境,成体干细胞也能够分化成多种不同类型的细胞,表现出一定的多能性 [17~20] 。

Bjornson等人报道,将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后的小鼠的循环系统中,可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞,这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力 [21] 。Margaret A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞,它能够分化成几乎所有种类的血液细胞,而且效力比完全的骨髓成分高10~14倍 [22] 。此外,陆续还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞 [23] ;小鼠血液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞 [24] ;人和小鼠神经干细胞分化成骨骼肌细胞 [25] ;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞 [26] ;人体血液干细胞转化成肝脏细胞 [27] ;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细胞 [28] 。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出多种细胞类型特有的相关基因的表达 [29~30] ,以及当B淋巴细胞细胞的正常分化由于Pax5的缺失被阻断后,B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细胞 [31] 。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的状态,在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。

以 上的发现要应用于临床还存在操作上的困难,必须寻找一种更容易得到,更容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞,这种细胞可以从成人骨髓中分离得到,能在去分化的状态下稳定复制,并能分化成多种间质组织包括骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等 [32~33] 。最近,从脂肪组织中分离出干细胞,它能分化成脂肪、软骨、肌 肉和骨组织 [34] ;另外从啮齿动物真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞,可能可以作为未来理想的干细胞来源 [35] 。但到目前为止,成体干细胞能转化的细胞类型还十分有限,因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之,胚胎干细胞的研究及应用,将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程,给人类带来全新的医疗方法。随着研究的深入,许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干细胞及其相关技术而被治愈。

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胚胎干细胞范文第8篇

成年心脏心肌的再生能力有限,发生器质性损伤后,常导致不可逆的心脏功能减退。目前,药理、介入、外科等方面的治疗效果仍十分有限。ESC具有强大的分化潜能和增殖能力,能定向分化为结构、功能典型的具有收缩能力的心肌细胞,用于治疗心血管疾病有良好的前景。这一方面的研究目前还处于较基础的环节。

1 ESC可向心肌细胞分化

ESC主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑堪胚之前的早期胚胎细胞,经体外培养可以分化为心肌细胞。Kehat[1]对由鼠ESC(mESC)分化的心肌细胞进行了一系列鉴定:免疫组化染色显示α-MHC、α-actinin、cTnI、desmin、ANP等心肌特异蛋白都有表达;RT-PCR提示心脏特异的基因cTnI、cTnT、GATA4、human ANP、MLC-2A、MLC -2V、Nkx2.5和α-MHC特异表达;电镜观察到缝隙连接和桥粒,并且随着培养时间的延长,细胞内肌小节排列渐趋整齐;电生理也显示了典型的兴奋收缩偶连反应。Baharvand等[2]则进行了体内、体外分化情况的对比研究进一步支持了其定向成熟分化。Laura等[3]将人胚胎干细胞(hESC)体外诱导分化的心肌细胞,培养观察了达3个月,并通过膜片钳等技术来评估其功能成熟情况,以RT-PCR来评估编码离子通道的亚基的表达;可发现随着体外培养时间的延长,ESC分化的心肌细胞愈接近成熟心肌细胞表型。

2 定向诱导ESC向心肌细胞分化

ESC 体外分化为心肌细胞,一般采用胚胎体(EB)形成法,而EB自然分化得到的心肌细胞比较少,约5%[4]。大量的研究[5]认为转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白(Wnt families)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及全反式维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和垂体后叶素、维生素C、5-氮胞苷等可以促进ESC分化为心肌细胞。血清的影响近年来也受到重视, Passier等[6]采用无血清培养基诱导胚胎干细胞,发现心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍,如果在培养体系中加入维生素C,分化效率还可以再提高40%;Pal等[7]则发现低浓度血清(5%)维持及有BMP-2(25 ng/ml)的共同作用下,有利于人胚胎干细胞株BG01V和ReliCell((R))hESC的分化。除了提高心肌细胞在胚胎干细胞分化群落中的比例,Wang等的研究[8]发现旋转的细胞培养系统不但利于ESC分化形成EB,且分化得的心肌细胞成熟度优于普通悬浮培养,并能在3D胶原支架上形成组织。

3 纯化已经分化的心肌细胞

ES细胞可分化为心房肌、心室肌、房室结、蒲肯野细胞和窦房结样细胞。多种心脏细胞类型的混合物移植后,很可能导致心律不齐,不利于长期心功能的维持;纯化分化的心肌细胞,是临床应用的前提。MLC-2v启动子可特异地使心室相关基因表达,Muller等为ESC构造了CMVenh/MLC-2v启动子,使增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达,通过FACS筛选阳性细胞,特异地纯化了心室肌细胞,基本除去了心房肌细胞,但纯化生产大量ES细胞源心室样心肌细胞仍是ESC应用于心血管疾病治疗的一大障碍。目前hESC向心肌细胞诱导分化率较低,而且仅有早期心肌细胞的结构和特性,尚未建立有效的筛选纯化技术。有研究提出可通过添加细胞因子,经Percoll密度梯度离心分选获得,但经此分选后的心肌细胞活性肯定受到很大影响,体内是否具有参与心脏重建功能还有待验证。

4 移植细胞的选择

ESC的治疗属于细胞移植治疗,尚在摸索阶段。用未分化的ESC进行移植是一种探索,早期研究发现未分化的ESC进行移植,可改善心功能;近年Nussbaum等[9]的研究发现未分化的鼠胚胎干细胞不适合移植治疗,无论是在正常或是有梗死发生的心脏,不仅没有明显的心肌细胞分化,而且会形成畸胎瘤和发生免疫应答;故认为应该进行定向诱导后再用于移植治疗。

5 移植途径的选择

目前的实验中有以下移植途径:(1)经静脉移植:冠状动脉血流量约占心排血量4%,经静脉移植效率十分低下。在心肌梗死急性期,大量炎性介质释放使梗死区及周边毛细血管通透性增加,这可能使干细胞经冠状动脉移植成功,但此期心肌炎症反应较强,又容易导致移植细胞死亡。(2)心肌内注射:通过特制的针进行心肌内注射,靶部位可以是正常心肌、梗死边缘带或是以上二者的联合,适合与冠状动脉搭桥术同时进行,目前仅用于动物实验。(3)心内膜心肌内注射:心脏自动导航系统能够实现经心内膜心肌内注射,创伤小、安全性高,但移植细胞可随心脏运动从针孔溢出,无法均匀分布,可能造成移植后心室运动的不协调;且注射部位、注射剂量以及移植细胞在损伤心肌中的生存条件还需要进一步阐明。找到高效、安全的移植途径是临床应用前必须解决的问题。

6 移植免疫

细胞的免疫原性主要是由I型主要组织相容性抗原(MHC I)介导的。hESC虽然只表达低水平的MHC I类抗原,但移植治疗时仍存在移植排斥反应。目前提出了一些解决ESC移植排斥反应的可行途径:(1)体细胞核转移(SCNT):即治疗性克隆技术。将患者的体细胞核移入去核的卵母细胞中,体外培养形成含有患者遗传信息的ES细胞系,再将其诱导分化成特定细胞(如:心肌细胞)进行移植。(2)通过转基因技术向ESC转染患者组织相容性抗原(MHC I)基因。(3)建立ESC细胞库,将具有不同组织相容性的ES细胞系冻存建库。(4)通过基因敲除去ESC的MHC基因,建立可共用的供体ESC细胞系。此外,有研究者提出把ESC分化的多能造血干细胞移植到已去除T细胞的受者体内,使受者和供者干细胞形成嵌合体,新生成的T细胞将对移植的心肌细胞形成特异的免疫耐受,达到稳定的中枢清除性耐受,这样受者无需事先进行免疫抑制。Fandfich等直接用大鼠胚胎干细胞(RESC)打入MHC配型不符的大鼠门静脉,发现可形成稳定的造血干细胞嵌合体,并成功地诱导对移植心脏的耐受。其具体机制还不清楚,可能是因为RESC不表达免疫刺激因子,不能触发T细胞的反应;另外RESC表达FASL,与带有FAS的免疫细胞接触后触发免疫细胞的凋亡 。近年有研究[10]发现在有免疫活性的小鼠体内移植ESC未观察到免疫耐受或淋巴嵌和现象,但观察到有免疫赦免,会允许ESC形成畸胎瘤。

7 安全性评价

由ESC分化的心肌细胞移植到体内后可能受到局部微环境信号的影响发生变化,目前尚无一个统一的标准对细胞发生的恶性转化加以确定,有必要进行多项指标的评估:(1)形态学特征的改变。(2)刀豆球蛋白A(ConA)凝集试验观察细胞表面结构的改变。(3)锚定非依赖性生长(AIG)。是细胞癌前转化的特征,同时也是检测细胞恶性转化的重要指标。(4)染色体核型分析。(5)动物体内成瘤性检测。Koch等[11]发现由ESC形成的肿瘤部分地受控于补体的旁路途径,对补体的易感性也是与ESC形成肿瘤的能力相关的; Behfar等[12]发现TNF-α这种程序重排细胞因子在体内可以促进ESC向心肌细胞的分化,这种作用也许可以抑止ESC在分化中发生肿瘤。建立严格控制的标准化干细胞培养体系对于保证干细胞生物学特征的稳定及增强移植的安全性具有重要意义。移植后长期的安全性评价很少,有待于进一步研究。

8 ESC移植治疗的动物实验

Min等将小鼠ESC分化的心肌细胞用GFP基因进行转染,然后移植到梗死的大鼠心脏,于第六、三十二周观察,免疫荧光证实GFP基因在心脏表达,植入区的毛细血管增加且大鼠的存活率提高,这说明移植的细胞能长期存活,并保持良好的功能状态[13]。Yang等将血管内皮生长因子(VEGF)基因转入ESC,这种转基因的ES细胞在体外诱导分化后移植到梗死的心脏,显著增强了心脏的收缩力,免疫组化显示梗死区域新生血管大量形成[14]。ESC源性心肌细胞移植后促进心功能的恢复,得益于有功能的心肌细胞取代了疤痕组织,使梗死面积减小,减少了梗死局部心肌细胞的凋亡[15],也使正常心肌组织过度牵张程度降低,保护了其收缩功能。另外,移植细胞可以释放一些心脏保护因子,如VEGF等,促进心脏功能的更好恢复。但是,移植细胞能否完全整合入心脏组织,是否导致心律失常以及远期后遗症等问题还有待研究。现在的实验研究多基于啮齿类动物,相对较短时间内观察到心功能改善,在更长时间内的效果及在大型动物和灵长类的实验模型涉及尚少。故在评价动物模型时,应该注意基因表达、细胞信号途径、物种体内生物学环境等方面的差异,注意实验室结果与临床实践运用的差异性,对其临床运用的可能给予恰当评价。

ESC不可避免地需要来源于胚胎组织,我国学者赞成以维护和提高人类健康为目的的hESC研究,强调必须严格、审慎,坚持伦理原则,严格控制使用人为配子制造的胚胎和克隆人的胚胎。作为当今医学生物技术研究的前沿领域,ESC在心血管疾病治疗方面的研究必将为心血管疾病的治疗展开新的篇章。

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胚胎干细胞范文第9篇

【关键词】 胚胎干细胞; 神经细胞; 分化

Progress in directed differentiation of mouse embryonic stem cells into neural cells

【Abstract】 Mouse embryonic stem cells can give rise to ectodermal derivatives in culture and can be further induced into neurons and glia for cell-replacement therapies in the central nervous system and for use in drug discovery. The methods of directed differentiation of mouse embryonic stem cells into neural cells include neural differentiation from embryonic stem cells via embryoid bodies, stromal cell induced neural differentiation, default model mediated neural differentiation, adherent monoculture induced neural differentiation, genetic engineering mediated neural differentiation and so on. Here we review these methodologies.

【Key words】 embryonic stem cell; neural cell; differentiation

小鼠胚胎干细胞于1981年首次由Evans和Kaufman[1]成功分离建系,它们来源于胚泡的内细胞团(inner cell mass , ICM),这些细胞具有稳定的二倍体核型,在体外可以分化为三个胚层的多种细胞。将小鼠胚胎干细胞重新植入胚泡可以参与形成胚胎。体外ES细胞维持未分化状态依赖于一些细胞因子的存在,如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor , LIF)[2]。撤去这种自我更新的刺激信号后,ES细胞很快分化为多种细胞。这些属性使ES细胞成为非常有用的发育生物学和功能基因组学研究的生物系统[3]。

1 拟胚体(embryoid bodies, EBs)内神经细胞的分化

小鼠ES细胞通过拟胚体分化为神经细胞主要有以下两种方案。

1.1 “4-/4+方案”[4] 将小鼠ES细胞无LIF培养4天,形成EB;再用维甲酸(retinoic acid, RA)处理4天,然后在明胶(gelatin)[5]或层粘连蛋白(laminin)[4]包被的组织培养皿上培养[6]。培养6天后,细胞出现明显的神经细胞形态,开始表达神经细胞特异的基因,如神经微丝轻链(neurofilament light chain)、微管相关蛋白2和5(MAP2、MAP5)等。这些细胞对一系列神经递质和去极化电流起反应,证实了它们是可以传递兴奋的神经元。这一方案还会分化出神经胶质细胞,多数为星形胶质细胞,但也有少突胶质细胞的存在[7]。RA是一类促神经生长因子,不仅对多潜能干细胞有诱导作用,对神经前体细胞也有促进增殖、成熟的作用。RA与受体RAR、RXR结合,后者活化后与RA反应元件(RARE)结合,激活神经细胞相关基因并抑制中胚层相关基因的转录[8]。Wiles 等人的实验表明RA通过激活抑胰蛋白(follistatin)抑制骨形态形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)而使小鼠ES细胞向神经细胞方向分化[9]。

该方案时间短、成本低,是目前使用较为广泛的神经细胞诱导方法。其不足之处是EB的外层细胞先分化而内层细胞仍保持未分化状态, 分化不均一,得到的细胞种类复杂,不利于纯化。

1.2 “五步法”方案[10] (1)扩增未分化的胚胎干细胞;(2)去除分化抑制剂或促有丝分裂素,ES细胞开始分化,不贴壁悬浮生长,形成EB;(3)去除生长因子,选择巢蛋白(nestin)阳性细胞(即神经前体细胞);(4)使用神经细胞培养液,添加生长激素、神经营养因子,扩增神经前体细胞;(5)利用促神经元存活因子诱导并维持神经元成熟。该方案不用RA处理EB,而是将EB在一种选择性的无血清培养基上培养。因为EB中的非神经细胞不能在这种培养条件下生存,所以大部分存活下来的细胞是nestin阳性的神经前体细胞[11]。这些神经前体细胞可被高效地诱导分化为神经元[12]。

该方案的主要优点是在进一步分化为神经元或神经胶质细胞之前,神经前体细胞已经得到较高的纯化,这有利于特定类型神经细胞的获得。但是,其操作较“4-/4+方案”复杂,而且多种生长激素、神经营养因子的应用增加了成本且不利于分化机制的阐明。

通过EB途径由ES细胞分化而来的神经元多数为γ-氨基丁酸(GABA)能神经元,少数是谷氨酰胺能神经元。通过改变诱导分化的条件,可以得到不同类型的神经元或神经胶质细胞,并提高分化效率。腹侧中脑和后脑是多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元产生的部位,SHH(sonic hedgehog)和FGF-8(fibroblast growth factor-8)对这两部分的形态发生起重要作用[13],Lee等人[10]用这两种分子处理EB来源的神经前体细胞得到了多巴胺能神经元和5-羟色胺(5-HT)能神经元。 2002年Wichterle等人[14]用背侧分子(RA)和腹侧分子(Hh-Ag1.3,一种SHH的拮抗剂)处理EB,得到了腹侧脊髓运动神经元。2005年Tsuchiya等人[15]在经典的“五步法”方案基础上,在第五步除去bFGF(basic fibroblast growth factor),用含有层粘连蛋白的N2培养液中成功诱导分化出微小胶质细胞,并进一步用含有胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)的RPMI-1640培养液扩增细胞,得到89.0%的微小胶质细胞。

2 基质细胞诱导的神经细胞的分化

第二类诱导神经细胞分化的方法是基质细胞诱导方法,该方法的诱导机制尚不清楚,目前称为“基质细胞来源的诱导活性作用(stromal cell-derived inducing activity , SDIA)”[16]。

2000年Kawasaki等人描述了一种经基质细胞诱导ES细胞分化为多巴胺能神经元的方法[16]。这一方法中,神经细胞的分化通过ES细胞与小鼠骨髓来源的基质细胞PA-6细胞单层共培养而实现。实验结果表明,92%的细胞表现为神经细胞黏附分子(nerve cell adhesion molecule, NCAM)阳性,其中多数为酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)阳性细胞。酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成的限速酶,因此是多巴胺能神经元的一个很好的分子标志。2005年Yamozoe等人[17]用含有肝素的磷酸盐缓冲液冲洗培养的PA-6细胞得到含有所谓神经诱导因子(neural inducing factors, NIF)的溶液,用此溶液培养小鼠ES细胞,发现小鼠ES细胞可以在含有33%NIF溶液的培养液中生存,并且随着培养液中肝素浓度的增加,ES细胞分化为神经细胞的比例也增高。值得注意的是,PA-6细胞介导的神经细胞分化受到血清或BMP-4的抑制,血清和BMP-4的加入可引起ES细胞分化为多种非神经细胞。PA-6细胞的SDIA作用并不能使所有类型的干细胞诱导分化为多巴胺能神经元,例如,2005年Roybon等人[18]报道,对于神经前体细胞,PA-6细胞不能促进其向多巴胺能神经元分化,而是促进其向星形胶质细胞的分化。

2003年Barberi等人[19]描述的一种经基质细胞诱导分化的方法可以将ES细胞分别诱导分化为多种神经细胞。这一方法将小鼠骨髓来源的基质细胞MS5或S17或主动脉-性腺-中肾区来源的原始基质细胞作为饲养层细胞与ES细胞在血清替代培养液中共同培养,得到神经前体细胞,再用不同的细胞因子序贯处理这些神经前体细胞,分别可以得到较高百分比的胆碱能神经元、5-羟色胺能神经元、多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。将得到的多巴胺能神经元注射到6-OHDA诱导的帕金森模型动物的患侧纹状体内,8周后由中枢神经系统兴奋剂amphetamine或者纹状体D1、D2受体激动剂apomorphine所诱导的旋转不稳定症状得到了显著改善,并且可以在注射细胞的纹状体内发现大量的酪氨酸羟化酶阳性细胞。

基质细胞诱导神经细胞分化的方法可以高效获得某种特定的神经细胞,例如,多巴胺能神经元和胆碱能神经元。然而,作用机制还有待进一步阐明。

3 默认模式(default model)介导的神经细胞分化

2001年Tropepe等人[20]发现小鼠ES细胞在低密度、无血清、无饲养层细胞的条件下培养7天后,约0.2%的细胞可形成神经球(neurosphere),并进一步自发分化为神经细胞,这种分化方法称为默认模式。这是抑制神经分化的信号分子表达降低的结果。Wiles等人[9]发现在神经分化过程中,可以检测到BMP、TGFβ等基因的表达下调。BMPs在神经发育早期与细胞表面丝/苏氨酸受体结合激活Smad蛋白,后者进入核内抑制Mash1、Math1、Ngn1/2、NeuroD等转录因子的活性,调节下游基因的表达,从而抑制神经分化[21]。BMP4处理的小鼠ES细胞在分化过程中神经元数量大为减少[22];而用 noggin、follistatin、chordin、Cerberus等BMPs的拮抗剂处理小鼠ES细胞则可促进ES细胞向神经细胞方向的分化。

该方法促进神经分化的效率较低,单独应用此法诱导神经细胞分化并不多见。

4 单层粘附培养诱导的神经细胞分化

2002年Pacherník等人[23]在不形成EB和不用RA处理的情况下,将小鼠ES细胞生长在含有胰岛素(insulin)、转铁蛋白(transferrin)、硒元素(selenium)和纤连蛋白的无血清DMEM/F12培养液中,发现分化的细胞多数表达MAP-2等神经细胞的标志性蛋白。2003年Ying等人[24]将细胞密度为0.5~1.5×104/cm2的小鼠ES细胞培养于0.1%明胶包被的组织培养皿上,以N2B27作为培养液,培养4天后,60%以上的细胞分化为神经前体细胞。该方法形成的神经前体细胞具有良好的可塑性:神经前体细胞在N2B27培养液中培养,得到的细胞多数为GABA能神经元;FGF8和SHH处理神经前体细胞可以得到较多的多巴胺能神经元。

此类方法将形成EB的三维培养模式简化为单层粘附培养的模式,降低了复杂程度,有利于神经细胞分化早期事件的分子机制研究,而培养液中各成分发挥的作用需要进一步阐明。

5 遗传工程介导的神经细胞分化

2002年Chung等人[25]将Nurr1(nur相关因子1)基因导入小鼠ES细胞,使其过表达,从而诱导ES细胞分化为具有中脑多巴胺能神经元表型的细胞。Nurr1是一种转录因子,直接结合于TH基因的启动子区域,调节维持中脑多巴胺能神经元表型的蛋白质的表达,如L-芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase, AADC)、囊泡单胺转运蛋白2(vesicular monoamine transporter 2, VMAT2)[26]和多巴胺转运蛋白(dopamine transporter, DAT)[27]。将这种方法得到的多巴胺能神经元注射到脑内可以改善帕金森模型大鼠的运动缺陷[28]。该方法存在的问题是,在神经细胞分化之前过表达Nurr1会上调其他多巴胺能神经元分子标志的表达,而且由ES细胞分化的其他细胞也会出现这种情况[29]。

2004年Ikeda等人[30]将MASH1基因导入小鼠ES细胞,该ES细胞多数分化为表达βⅢtubulin和泛NCAM(pan NCAM)的神经元样细胞,其中半数进一步分化为Islet阳性的运动神经元。MASH1是一种激活型碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子,表达于腹侧端脑,调节GABA能中间神经元和分支运动神经元的发育[31]。将得到的运动神经元样细胞注射到偏瘫小鼠脑室周围的运动皮层,可明显改善运动障碍。

遗传工程介导的神经细胞分化方法的优势是可以较高效率地得到感兴趣的特定的神经细胞。但是由于导入基因的功能多样性和不确定性,较难判断该基因对细胞的整体影响和长远影响。

6 问题与展望

虽然小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法取得了较大进展,目前可以较高效率地得到中枢神经系统的各种神经元和神经胶质细胞,但是仍有许多问题亟待解决。首先,虽然“五步法”方案解决了“4-/4+”方案中分化细胞不易纯化的问题,但是其分子机制尚待进一步阐明、操作步骤需要进一步优化;其次,SDIA诱导方法的作用机制和单层粘附培养的作用机制需要进一步阐明,这将会有利于我们对神经细胞分化过程中信号通路的掌握;再次,遗传工程方法导入的基因对细胞的长远影响需要进一步观察和研究;还有,现在所得到的神经细胞类型还不很明确,因为神经元和神经胶质细胞还可以分为很多亚型。例如中枢神经系统的胆碱能神经元根据形态和生化特性就可以分为不同亚型,它们的分布和生理功能也不尽相同。因此有必要获得特定部位和类型的神经细胞。

ES细胞向神经细胞分化的研究有利于人们了解胚胎神经细胞发育的机制、发现ES细胞向神经细胞分化的关键调节基因;建立体外定向诱导神经细胞分化体系将为神经疾病治疗药物的筛选以及基因工程药物的开发等提供有用的材料;体外大量有功能的特定神经元的获得使神经再生医学正一步步从理论走向实践。

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胚胎干细胞范文第10篇

据英国媒体报道,英国研究人员首次用3D打印机打印出胚胎干细胞,干细胞鲜活且保有发展为其他类型细胞的能力。我们知道,胚胎干细胞存在于胚胎发育早期的囊胚中,可发育为不同的细胞,是所有细胞最初期的形态。胚胎干细胞是万能的,意味着它们可以发育成为身体内200多种细胞类型中的任何一种。研究人员说,这种技术或可制造人体组织以测试药物,制造器官,乃至直接在人体内打印细胞。

胚胎干细胞3D打印机配备两个“生物墨盒”,一个装着浸在细胞培养基中的人体胚胎干细胞,另一个只有培养基。计算机控制微调阀喷出“墨水”,其速度可通过改变喷口直径实现精确控制。

打印机上有显微镜,可以观察细胞打印情况。两种“墨水”一层一层间隔喷洒,形成不同浓度细胞飞沫,最小飞沫体积仅2纳升,包含大约5个细胞。飞沫被喷入有诸多凹孔的培养皿中,翻转培养皿,飞沫形成悬液,在各凹孔内“抱成团”。打印机可精确控制飞沫大小,使干细胞达到分化的最佳状态。

研究人员在《生物制造》杂志说,检测结果显示,打印24小时后,95%以上细胞仍然存活,打印过程未杀死细胞;打印3天后,超过89%细胞存活,而且仍然维持多能性,即分化出多种细胞组织的潜能。

研究人员已经用3D打印的干细胞制造出骨髓和皮肤。他们认为,最终能借助这种方法制造器官,从而无需器官捐献,同时还可以解决器官移植中的免疫抑制等问题。

英国《每日邮报》援引该研究主持者威尔·舒的话报道说:“就我们所知,这是这些细胞(人类胚胎干细胞)首次用3D技术被打印出来。这一技术可以让我们制造出更精确的人体组织模型。就长期来看,我们认为这项技术将进一步发展,实现用患者自己的细胞制造3D器官用于医疗移植,干细胞技术将取得巨大进步,把细胞变成你想要的(组织或器官)。”

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