胰岛素对全脑缺血再灌注大鼠脑HSP70表达的作用

摘要：目的　探讨胰岛素对脑缺血再灌注损伤的中枢保护机制。方法　通过胸部挤压建立心脏骤停后完全性全脑缺血再灌注模型，观察HSP70在脑组织的表达情况。结果 与对照组相比，胰岛素并不能显著上调缺血大脑的HSP70表达。结论 胰岛素对全脑缺血大鼠大脑的HSP70表达没有显著影响。

关键词：胰岛素；脑缺血；再灌注损伤；HSPT0

中图分类号：R743．31 R255．2

文献标识码：A

文章编号：1672―1349(2007)06―0506―02

细胞受热及其他刺激后发生热休克反应，诱导热休克基因的转录和翻译，生成热休克蛋白(HSP)，HSP通过发挥分子伴侣等功能对细胞损伤具有保护作用。HSPT0在正常脑组织中不表达，多种应激所致脑组织损伤可诱导HSP70基因表达，对损伤细胞有保护作用。HSP70的存在代表损伤处于可修复阶段，也是脑缺血损伤后敏感且可靠的标志。HSP70在完全性全脑缺血再灌注脑组织的表达情况如何，胰岛素对完全性全脑缺血再灌注脑组织HSPT0的表达的影响和其脑保护作用如何均未见报道。近年有较多实验观察到胰岛素能明显改善脑缺血的神经功能障碍及病理损害，对缺血脑组织具有不依赖于其降糖作用的直接保护作用。胰岛素脑保护的可能机制有增加细胞外r-氨基丁酸的水平、促进细胞内Ca2外流、清除自由基、激活Na+-K+-ATP酶及抑制除极等。本实验通过胸部挤压建立一种心脏骤停后完全性全脑缺血再灌注模型，观察HSP70在脑组织的表达情况，研究胰岛素对完全性全脑缺血再灌注的脑保护作用与HSP70的关系。

1材料和方法

1．1动物准备和实验分组　成年健康SD大鼠36只，200g～300 g，随机分成正常对照组(对照组，非手术大鼠)、安慰剂组(生理盐水治疗)、治疗组。治疗组予胰岛素4U／d。各组又分别以治疗天数不同分为两组，每组6只。

1．2模型制作和给药方法　心脏骤停模型制作：大鼠麻醉后仰面固定，3kg重量压迫胸腔，心电图全程纪录，造成心脏骤停(心电图呈直线)20s后，移开重物，心脏自主电活动恢复。麻醉方法：腹腔内注射氯胺酮60 mg／kg麻醉。治疗组(每日注射胰岛素4U)，10％葡萄糖10 mL+胰岛素4U，腹腔内注射，每日两次，每次5mL。安慰剂组予等量生理盐水注射。

1．3免疫细胞化学和组织病理学观察　完成试验后，迅速处死大鼠。开胸暴露心脏，经升主动脉插管，生理盐水100mL快速灌洗，4％多聚甲醛缓冲液(4℃)灌注115h，最后用15％蔗糖溶液灌注30min，4℃冰箱过夜。额部到枕部，进行石蜡切片。(5～8)μm用HE染色，光学显微镜下进行病理组织学观察。4 0tan切片采用ABC法，即将40pm的切片在30％Triton X-100液中孵育30min，把切片浸入鼠抗HSP70单克隆抗体(1：2 000，Sigma，USA)孵育48 h(4℃)。经过PBS洗约15min后，切片浸入生物素结合兔抗鼠IgG(1：200，Sgima，USA)室温孵育3h。再经PBS洗后，切片浸入ABC复合物(1：200，Sigma，USA)孵育3h。用PBS充分洗后，采用DBA法显色。空气中干燥，酒精梯度脱水、透明、中性树胶封固，在光学显微镜下观察HSP70表达。

1．4计算机辅助图像分析　经过免疫细胞化学染色的切片在光学显微镜下放大200倍，图像经过摄像机转变为电信号，再转换成可被计算机直接处理和储存的数字信号，并可同时在监视器上显示。每组大鼠取同部位切片，每张切片在皮层HSP70表达区选5个视野，进行着色细胞图像分析，然后计算HSP70阳性细胞的个数，进行半定量测量。

1．5统计学处理　用x2检验。

2结果

在对照组即假手术组中未见HSP70蛋白表达，在安慰剂组与治疗组中HSP70的表达均有显著增高，但两组对比无明显差异，并且治疗时间3d与6d对比，HSP70蛋白表达无明显差异。详见表1。]

3讨论

热休克蛋白又称应激蛋白(stress protein)，是1962年Ri－toy6a在经过非致死性热处理的果蝇唾液腺细胞中发现的。现已被认为是对缺血性损伤有重要保护作用的应激蛋白，根据相对分子质量不同分为HSP70、HSP90、HSP27等家族，其中HSP70与脑缺血再灌注损伤最为密切。HSP70在正常条件下不表达或表达极少，在应激条件下，当其他蛋白合成明显受到抑制时，HSP70反而过度表达，因而被认为对机体有保护作用。近年研究表明，正常脑组织中检测不到HSP70，在短暂非致死性脑缺血后，受损伤细胞的变性蛋白可以诱导HSP70的合成，同时也获得暂时的对随后致死性缺血性生损伤的耐受。其机制可能为：HSP70发挥“分子伴侣”的作用，促进新生多肽链的正确折叠，阻遏蛋白错误折叠。在缺血、缺氧等情况下，白变性，暴露出疏水区，并相互作用而聚合，并且与自胞质进入到细胞核内的少量HSP70结合，使得本来与HSP70结合的热休克转录因子(HSF)分离，转移到细胞核中与HSP70基因启动子定的核苷酸序列即热休克元件(HSE)结合，从而启动HSP的转录，HSP70mRNA转移到核外大量合成HSP70，在细胞质中与变性蛋白结合，维持蛋白自身稳定；进入核内与核糖体前体及其他核内蛋白结合，防止变性引起生命信息紊乱。

在本实验中，通过注射胰岛素来观察其对中枢的直接作用机制。从实验结果可以看出，在对照组中未见HSP70的表达，在缺血再灌注模型的胰岛素治疗与安慰剂组中，HSP70蛋白均明显增加。这与以往的文献报告一致，提示脑缺血再灌注损伤可诱导神经元HSP70的表达。本组实验还表明，胰岛素治疗与安慰剂组相比，并不能明显上调HSP70的表达，并且实验时间3d与6d组相对比，表明此结果与治疗时间无关。

以往有文献报道，HSP70表达最多的脑区是缺血侧皮质周围及对缺血耐受的海马齿状回颗粒细胞层，在缺血中央区以及对缺血敏感的海马CAI区未见HSP70的表达。Welsh等研究发现爱梗死中央区有HSP70mRNA的大量诱导而无HSP70蛋白的表达，并认为HSP70基因转录与翻译水平的分离是神经元严重缺血的标志，与细胞损伤有密切关系。本实验采用心脏骤停模型造成全脑缺血缺氧，并且标本切片自额部到枕部切片，避免了可能由于结扎颈内动脉仍有其他血管代偿或因切片部位的选取而造成的对实验结果的影响。

有资料显示，胰岛素能减轻脑缺血再灌注后细胞内钙超载，清除氧自由基，增加脑细胞外r－氨基丁酸的水平，拮抗兴奋性氨基酸的毒性作用。胰岛素是否通过对上述脑缺血再灌注损伤环节的调节，从而上调HSP 70蛋白的表达，有待进一步的研究。本课题得出的结论说明：胰岛素对全脑缺血大鼠大脑的HSP 70表达没有显著影响，可能是胰岛素对脑保护作用与HSP 70的相关途径没有明确的关系，为今后类似的研究方向，提供一些避免损失的证据，当然也需要对类似课题进行进一步的研究和观察。