选修三中动物细胞融合与单克隆抗体一节的重难点剖析

在动物细胞融合与单克隆抗体一节中教学的重点、难点都是单克隆抗体的制备过程。

单克隆抗体是指源自一个B淋巴细胞的克隆所产生的抗体，它只会特异性地作用于一种抗原决定簇。

在弄清什么是单克隆抗体之前，我们先让学生回顾一下抗体的基础知识，接着了解以下两个问题：传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？

1.获得抗体的传统方法及缺点。

传统的抗体产生的方法是向动物体内反复注射某种抗原，通过反复感染动物，使动物产生抗体。然后从动物血清中分离所需抗体。如此得来的抗体产量少，纯度低，且制备的抗体特异性差，难免含有所需抗体以外的多种其他抗体。

2.抗体是从何来的。

对于一种免疫刺激而言，由于抗原本身是一种复杂的大分子物质，在其表面通常具有多种抗原决定簇（抗原物质上被特异性识别的一些化学基因）。而不同的抗原决定簇的激发的免疫反应强度也有所不同，并且一个B淋巴细胞只可能产生一种针对某一种抗原决定簇的抗体。故此连续注射抗原时，一种抗原的多种抗原决定簇就会刺激多个免疫细胞增殖和分化，形成的浆细胞群就会合成并分泌多种抗体。像这样由同一抗原不同抗原决定簇而引发机体产生的不同类型的单一抗体，称为多克隆抗体。

比如某种病毒有三种抗原决定簇，当这种病毒入侵人体后，人的B淋巴细胞就受到病毒的刺激将产生针对此病毒的三种不同标志的特异性抗体，分别由三组人的B细胞产生。 要把抗体应用于人工被动免疫，必须制备针对某一特定抗原决定簇的单一类型抗体分子。

一个B淋巴细胞只可能产生一种针对其中一种抗原决定簇的抗体，基于这个特点，我们要想应用于人工免疫就是要获得大量的单一抗体。怎么解决这个问题呢？理想的设想就是要把发生单个免疫后的B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆化），形成细胞群，再由此细胞群分泌出化学性质单一，特异性强，灵敏度高的单克隆抗体。可是在自然情况下，不论生物体内还是生物体外都不可能让B淋巴细胞进行大量增殖，特别是在体外培养条件下会很快死亡。

那么，米尔斯坦和柯勒这两位科学家是如何解决此问题的呢？他们设计了极富有创造性的方案。其中用到了骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞是一种肿瘤细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞（杂交瘤细胞），既能大量增殖又能产生足够数量的特定抗体。

接下来，教师导入重难点的教学过程――单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程是怎样的呢？大致分为五个步骤：

（1）B淋巴细胞及骨髓瘤细胞的获得。

给小鼠注射特定的抗原。通过对小白鼠进行初次免疫，第二次免疫，加强免疫三个阶段，使小鼠产生免疫反应。从产生免疫反应小鼠的脾脏细胞中得到相应的抗体。说明在小鼠的脾脏细胞中形成了相应的B淋巴细胞，然后从免疫小鼠的脾脏中分离出B淋巴细胞（B），注意B淋巴细胞是一个系列（B1、B2、B3・・・・・・Bn）。

同时现行实验室所用的瘤细胞均是从Balb/c小白鼠品系诱导而来的次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型，提取并培养小鼠的骨髓瘤细胞获得大量的骨髓瘤细胞（G）。

（2）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合。

将含有B淋巴细胞的细胞悬浮液，与制备好的同系骨髓瘤细胞按一定浓度混合，加入促融剂聚乙二醇（PEG）或灭火的仙台病毒诱导融合，各种淋巴细胞将与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。

细胞间的融合是一个随机的生理过程，成功率较低且随机性大。细胞融合物中将以多种形成出现：有骨髓瘤―骨髓瘤融合细胞（GG），B淋巴―B淋巴融合细胞（BB），骨髓瘤―B淋巴融合细胞（BG）即杂交瘤细胞，还有未融合的骨髓瘤细胞（G），B淋巴细胞（B），以及细胞多聚体（容易死亡，无需特别筛选）。因此必经通过筛选分离出既能分泌抗体，又能大量增殖的杂交瘤细胞（B1G，B2G，B3G・・・・・・BnG）

（3）杂交瘤细胞的筛选（第一次筛选）：在“选择培养基”上培养筛选 杂交瘤细胞。

选择性培养的目的就是筛选融合的杂交瘤细胞。一般采用HAT选择培养基，在HAT培养基中未融合的骨髓瘤细胞（G）及融合的骨髓瘤细胞（GG）因缺乏次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核糖转移酶而不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞（B）及融合的淋巴细胞（BB），虽具有次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，但本身在体外不能长期存活而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从淋巴细胞获得了次黄嘌呤―鸟嘌呤磷酸核糖转移酶并具有骨髓瘤细胞的无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活并增殖。

（4）杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆（第二次筛选）。

在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性抗体的细胞，因此必须进行筛选克隆化。通常采用“有限稀释法”进行杂交瘤细胞克隆化培养，采用灵敏、快速、特异的免疫学方法筛选出能产生单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。

具体做法是将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让细胞增殖，然后检验每个孔上清液中细胞分泌的抗体。其中上清液可与特定抗原结合的培养孔为抗体阳性孔，然后让这个孔的杂交瘤细胞进行克隆增殖并及时进行冻存。

（5）抗体的大量制备。

一般采用动物体内诱生法和动物体外培养法。

体内诱生法，就是将（产生特定抗体的）杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖的1～2周后，用注射器从腹水中抽取大量的单克隆抗体。

体外培养法，将杂交瘤细胞放入培养液中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞增殖并产生单克隆抗体，收集上清液离心去除细胞及其碎片，即可获得需要的单克隆抗体。

近年来各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了单克隆抗体的生产量。

在这个教学过程中，可以通过应用多媒体分段放映单克隆抗体的培养过程，让学生形象了解之后通过学生归纳其制备过程若干要点，再加上教师某些疑点的解释达到突破重难点的目的。

最后提问学生在这制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？（动物细胞融合技术，动物细胞培养技术）让学生知识结构系统化，条理化，达到优化这节课的目的。