丁苯酞预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后HSP70与TLR4表达的影响

摘要：目的观察热休克蛋白（HSP70）与Toll样受体4（TLR4）在局灶性脑缺血再灌注中的表达规律及丁苯酞（NBP）预处理对其表达规律的影响，探讨NBP预处理防治脑缺血的作用。方法72只成年雄性Wistar大鼠随机分为假手术对照组、NBP预处理组（缺血再灌注组），根据再灌注时间不同分为再灌注6 h、12 h、24 h、48 h亚组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶缺血再灌注模型，HE染色观察脑组织形态病理学变化；采用DNA原位末端缺口标记法（TUNEL）检测神经元凋亡；免疫组化法测定大鼠脑缺血再灌注不同时间HSP70与TLR4的平均灰度值。结果与假手术组比较，缺血再灌注组HSP70在缺血再灌注6 h明显升高，于24 h达到峰值（P

关键词：丁苯酞 脑缺血再灌注损伤 热休克蛋白70 Toll样受体4 凋亡 炎症反应

中图分类号：R743.31文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0572-02

热休克蛋白（HSP70）对坏死和凋亡都有抑制作用［1］，而其作为内源性配体又可激活Toll样受体4（Toll like recptor4，TLR4），内源性配体激活TLR4可能是缺血再灌注损伤中最主要的炎症应答的触发器［2］。丁苯酞能够在多个病理环节有效治疗急性脑缺血性损伤［3］。本实验旨在研究丁苯酞（NBP）预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间点HSP70与TLR4表达的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的防治。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂及仪器72只健康成年雄性Wistar大鼠，体重（230±10）g，山西医科大学生理实验室。丁苯酞(石药集团恩必普药业有限公司,批号:10010411)。兔抗鼠HSP70单克隆抗体、兔抗鼠TLR4单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均为北京博奥森生物技术有限公司，10%水合氯醛、4%多聚甲醛、25%乌拉坦、PM-10AD光学显微镜（Olympus optical Co.Ltd,JAPAN）、BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司，由山西医科大学生理教研室提供）。

1.2动物分组、模型制备与给药72只健康雄性Wistar大鼠随机分为：假手术组，NBP预处理组，局灶脑缺血1 h后再灌注组。每组又分为再灌注后6 h,12 h,24 h,48 h，每个时间点6只。NBP预处理组在缺血前3 d每天按体重经腹腔注射NBP80 mg/kg,假手术组与缺血再灌注组予以等体积生理盐水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，参照Zea longa线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，缺血1 h后实施再灌注。假手术组插入深度为8 mm，其余操作同缺血再灌注组。实验过程中和动物苏醒期间保持动物体温在(37±0.5) ℃，直至动物苏醒，予以神经功能评分。以大鼠手术麻醉清醒后神经功能缺陷评分在1分～3分，无蛛网膜下隙出血动物进行实验。0分、4分或死亡剔除，再随机补充。

1.3标本制备各组大鼠在规定时间点腹腔内注射25%乌拉坦4 mL/kg麻醉。结扎腹主动脉，开胸，经左心室灌注生理盐水100 mL冲净血液灌注4 ℃ 4%多聚甲醛200 mL。开颅取脑，置于10%中性甲醛溶液中保存24 h~48 h。取视交叉前后2 mm的大脑组织，固定脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚2 μm，60 ℃烤片2 h~4 h备用。每个脑组织共取片4套，分别进行HE染色，TUNEL,HSP70与TLR4免疫组化染色。

1.4指标检测

1.4.1HE染色观察脑组织切片常规脱蜡，HE染色，封片，光镜下观察。

1.4.2免疫组织化学染色采用SP法切片依次脱蜡，3%过氧化氢孵育15 min，PBS洗5 min×3次；高压抗原修复2.0 min；分别滴加1∶150的HSP70抗体与TLR4抗体，加入4 ℃冰箱过夜或37 ℃温箱孵育2 h；PBS洗5 min×3次；滴加二抗工作液，37 ℃温箱孵育30 min；PBS洗3 min×3次,DAB显色、脱水、复染、封片。每张切片于400倍光镜下随机检测缺血侧海马CA1区5个不重复视野HSP70与TLR4表达情况，分别计算HSP70与TLR4染色阳性细胞平均灰度值。

1.4.3TUNEL法检测凋亡每张切片于250倍光镜下随机计数缺血侧海马CA1区5个不重复视野阳性细胞数（胞核呈棕黄色颗粒），计算平均值。

1.5统计学处理采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示,行单因素方差分析ANOVA。

2结果

2.1HE染色假手术组缺血侧脑组织HE染色着色较深，细胞密度大，形态和结构无异常。缺血再灌注组脑组织梗死灶位于右侧额顶叶皮质和纹状体区，结构疏松成片状分布，可见间质水肿，有散在空腔。缺血中心区灶性细胞肿胀，溶解等坏死特征，梗死灶周围出现部分细胞核固缩浓染，核仁模糊或消失，细胞间质染色浅而不均匀偶见凋亡小体；随再灌注时间延长梗死灶周围具有凋亡性细胞形态的细胞神经细胞增多。缺血中心区和正常脑组织之间有一过渡区，细胞数量减少，部分胞体缩小，为缺血半暗区。NBP预处理组病理改变轻微，较少见神经元变性坏死。

2.2TUNEL检测结果缺血再灌注组对侧及假手术组大脑半球偶见凋亡细胞，推测系生理性坏死的神经元；缺血再灌注组缺血半暗带区可见大量凋亡细胞（P

2.3HSP70与TLR4免疫组织化学结果假手术组存在少量HSP70与TLR4表达,缺血再灌注组海马CA1区HSP70与TLR4显著升高,NBP预处理组HSP70升高，但低于缺血再灌注组（P

HSP70在胞浆中与变性蛋白结合维持蛋白自身稳定性，进入胞核与核糖体前体及其他核内蛋白结合防止其变性引起细胞生命信息紊乱。TLR4是天然免疫系统的一种模式识别受体，介导机体的天然免疫，而HSP70作为内源性配体可激活TLR4［4］，信号通过两条途径由胞外向胞内级联传递：My D88依赖途径和My D88非依赖途径，前者直接诱导炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的产生，后者依赖IFN调节因子3(IFN regulatory factor 3,IRF-3)的活化,诱导IFN-β和IFNα诱导基因(如IP-10)的生成，从而引起众多炎症因子表达。自1998年Poltorak等发现TLR4以来，其作为炎症跨膜受体在非生物性炎症损伤中起重要作用［5］。炎症反应参与了脑缺血再灌注损伤［6］。

丁苯酞可阻断脑卒中所致脑损伤的多个环节，具有较强的抗缺血作用。NBP预处理在防治脑缺血再灌注损伤的作用国内外鲜有报道。本实验研究发现，假手术组HSP70与TLR4表达较少，且各时间点无统计学意义。在缺血再灌注组HSP70于再灌注6 h表达增多，随时间延长表达逐渐升高，于再灌注24 h达到峰值。而TLR4于再灌注6 h就有较高表达，随时间延长表答逐渐增高，提示TLR4参与了脑缺血再灌注损伤的发展。与缺血再灌注组比较，NBP预处理组各时间点HSP70与TLR4表达较低，但均高于假手术组。本实验还发现，随再灌注时间延长，TLR4与HSP70各自表达高峰时间不一致,不排除脑梗死时缺血缺氧所促发的血管内皮通透性改变，脑组织坏死物质释放，吸引外源性的单核巨噬细胞、淋巴细胞趋化聚集，成为加剧炎性损伤的效应细胞，这些细胞均有丰富的TLR4表达，且HSP70被TLR4识别后可能增强了TLR4的表达，从而加重脑缺血再灌注损伤的发展。

NBP预处理可能通过抑制TLR4及内源性配体的表达来发挥防治脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡及非生物性炎症损伤。目前国内外把丁苯酞作为治疗缺血性脑卒中，但对其预防脑缺血再灌注损伤的机制尚需进一步研究。

参考文献：

［1］Sun Y,Ouyang YB,Xu L,et al.The carboxyl-terminal domain of inducible HSP70 protects from ischemic injury in vivo and in vitro［Ｊ］.J Cereb Blood Flow Metab,2006,26:937-950.

［2］Javier R,Caso,Jesus M,et al.Toll-like receptor 4 is involved in brain damage and inflammation after experimental stroke［Ｊ］.J Stroke,2007,3:1599-1608.

［3］崔丽英，李舜伟，吕传真,等.恩必普软胶囊治疗中度急性缺血性卒中的多中心开放临床研究［Ｊ］ .中国脑血管病杂志,2005,2(3):112-115.

［4］Jianlin G,Bangmin Z,Ayesha M,et al.T cell activation by hert shock protein 70 vaccine requires TLR signaling and scavenger receptor expressed by endothelial cells-1［Ｊ］.JImmunology,2009,183:3092-3098.

［5］Marsh BJ,Williams-Karnesky RL,Stenzel-PooreMP,et al.Loll-like recptor signaling in endogenous neuroprotection and stroke［Ｊ］.J Neuroscience,2009,158:1007-1020.

［6］Jasna K.Melanie Lalancette-Hebert:Inflammation,plasticity and real-time imaging after cerebral ischemia［Ｊ］.J ActaNeuropathol,2009,117:497-509.

作者简介:任建宏（1980―），男，毕业于长治医学院，现为山西医科大学2008级在读研究生（邮编030001）;刘瑞珍（通讯作者），工作于山西医科大学第二医院（邮编030001）。

(收稿日期：2010-12-13)