PM2.5不同成分在体染毒对大鼠肾血管环收缩-舒张反应及NOS /NO的影响

摘要：目的探究PM2.5水溶成分和脂溶成分对大鼠肾动脉收缩-舒张反应的影响及其作用机制。方法采用蒸馏水或有机溶剂分别提取PM2.5的水溶成分和脂溶成分。将大鼠随机分为3组，分别尾静脉注射PM2.5水溶成分、脂溶成分和混合成分，连续染毒10 d。采用DMT和PowerLab系统记录大鼠肾动脉血管环的张力；血清学检测大鼠NOS/NO系统变化。结果与对照组比较，PM2.5各染毒组加强氯化钾（KCl）和U46619对肾动脉血管环的收缩反应，但无统计学意义（P＞0.05），对乙酰胆碱(Ach)的舒张作用减弱（P

关键词：PM2.5 肾动脉血管环 收缩 舒张 NOS/NO

中图分类号：R544文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0564-03

大气细颗粒物(PM2.5)是指大气总悬浮颗粒物（TSP）中空气动力学直径≤2.5 μm的粒子［1］。PM2.5主要产生于交通、制造、能源等行业中的高温燃烧过程［2］。它的形态和组成相当复杂，含有机成分（如苯并芘等），无机成分如（硫酸盐、硝酸盐等），气态成分如(NO2、CO等)及生物成分（如内毒素）［1］。流行病学研究表明，PM2.5暴露与呼吸系统、循环系统及免疫系统等多种疾患具有相关性［3］。 基础研究中多通过气道染毒进行在体实验，或直接细胞培养进行干预实验。PM2.5水溶成分在体染毒可加强苯肾上腺素（PE）对大鼠胸主动脉血管环的收缩作用，减弱乙酰胆碱（Ach）所致的血管舒张作用［4］。但PM2.5其他成分在体染毒对心血管系统的损害研究较少，尤其是对小血管舒缩功能的影响研究鲜为报道。同时，PM2.5暴露对心血管系统损害的机制中，氧化应激引起内皮细胞功能障碍已成为共识。鉴于此，本实验采用PM2.5不同成分在体染毒大鼠，观察其对肾血管环舒缩的影响及NOS/NO系统的变化。以期阐明PM2.5不同成分在体染毒对小血管舒缩活动的影响程度及可能的相关机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂PM2.5自太原太钢地区采集，血栓素A2类似物（U46619），Ach,硝普钠（SNP），4-氨基吡啶（4-AP），HEPES均为Sigma公司产品。酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）测定试剂盒，血清NO测定试剂盒，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2实验动物与仪器雄性SD大鼠，约12周，体重250 g～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。动物饲养条件：每笼5只，自由摄食饮水。鼠饲料由山西医科大学实验动物中心提供。合格证号为医动字第100314。智能大容量空气总悬浮颗粒物无碳刷TH -1000C2型大流量采样器(武汉天虹公司)，玻璃纤维采样膜(河北省故城县环境监测器材厂)，四腔小血管环张力记录系统为丹麦DMT公司产品。Powerlab生物信号采集分析系统及其张力换能器为澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司产品。HSS-1B数字式超级恒温水浴泵为成都仪器厂产品。SZX-1LLB200解剖显微镜为日本Olympus公司产品。加样器为上海求精生化试剂仪器有限公司生产。Sartorius BS124 S 精密天平等。

1.2实验方法

1.2.1PM2.5成分提取及溶液配制PM2.5水溶成分提取及溶液配制,采样膜超声振荡30min~40 min，将滤膜上的颗粒物洗脱下来，取得PM2.5混悬液，离心,提取上清液将上清液通过三层滤膜。分装冷冻真空干燥,取得PM2.5 水溶成分干粉，保存于-20 ℃冰箱。临用前，称取一定量的水溶成分干粉，加入去离子水，超声振荡混匀，配制成一定浓度的 PM2.5 水溶成分溶液，在无菌条件下，将溶液通过0.22 μm滤膜于无菌瓶，溶液浓度6 mg/mL，4 ℃保存。

PM2.5脂溶成分提取及溶液配制,通过索氏提取器，利用二氯甲烷50 ℃水浴下4 h～6 h，提取采样膜上的PM2.5脂溶成分。于恒温水浴（40 ℃）锅上在风厨中蒸干，临用前，称取一定量的 PM2.5脂溶成分干粉，加入纯的二甲基亚砜（DMSO），快速混匀器混匀，使其充分溶解，溶液浓度800 μg/mL，DMSO浓度＜0.5％，4 ℃保存。

PM2.5混合成分溶液配制,将配制好的PM2.5水溶成分与脂溶成分溶液等容积混合，溶液浓度：水溶成分6 mg/mL+脂溶成分800 μg/mL，4 ℃保存。

1.2.2实验分组及染毒方法将大鼠随机分为对照组、水溶成分染毒组、脂溶成分染毒组及混合成分染毒组，每组10只。经鼠尾静脉注射染毒。对照组注射生理盐水，其余各组分别注射配制好的成分溶液，1 ml/kg，每天染毒一次，共10 d。

1.2.3大鼠肾动脉血管环的制备染毒10 d后，将大鼠击头致昏，立即开腹，经腹主动脉抽血后，快速取出肾脏，置于4 ℃ HEPES生理盐水中。血管环的制备、张力的记录方法同文献［5,6］。所抽血液静止放置0.5 h后离心，提取血清分装冷冻以备血清学检测。

1.2.4大鼠肾动脉血管环舒缩变化的测定血管环稳定2 h后，向浴管中加入KCl（60 mmol/L），当连续两次同样的刺激所

1)为山西省自然科学基金资助项目（No.2010011055-2）

引起的收缩幅度差别＜5％时，在此基础上Ach 10-5 mol/L所引起的舒张幅度≥30％时，认为血管活性良好。用新鲜的正常HEPES生理盐水冲洗标本3次，30 min后加入U46619（3×10-5 mmol/L），以收缩达平台稳定后为最大收缩值。

在KCl（60 mmol/L）、U46619（3×10-7 mmol/L）预收缩平稳的基础上，分别向浴管中加入不同浓度Ach（10-9～10-5 mol/L），SNP（10-9～10-5 mol/L）。观察在体染毒对大鼠肾动脉血管环舒张的影响。

1.2.5大鼠血清eNOS、NO含量及iNOS活性的测定采用ELISA测定血清内皮型eNOS含量。采用硝酸还原酶法测定血清NO含量。比色法测定血清诱导型iNOS活性。

1.2.6统计学处理检测结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0统计学软件处理,单因素方差及配对t检验分析。

2结果

2.1PM2.5各染毒组加强KCl和U46619对肾动脉血管环的收缩反应（见图1）。

图1PM2.5各染毒组对KCl和U46619收缩反应柱状图

2.2PM2.5各染毒组减弱乙酰胆碱对肾动脉血管环的舒张作用 （见图2）。 图2PM2.5各染毒组对乙酰胆碱舒张作用曲线图

2.3PM2.5各染毒组减弱硝普钠对肾动脉血管环的舒张作用（见图3）。

图3PM2.5各染毒组对硝普钠舒张作用曲线图

2.4PM2.5各染毒组对大鼠血清NO含量的影响（见图4）

图4PM2.5各染毒组血清NO含量柱状图

2.5混合成分染毒组大鼠血清eNOS含量（见图5）

图5PM2.5各染毒组血清eNOS含量柱状图

2.6PM2.5各染毒组大鼠血清iNOS活性（见图6）

图6PM2.5各染毒组血清iNOS含量柱状图

3讨论

在PM2.5水溶成分急性鼠尾静脉染毒1 h和6 h后，血清NO含量减少，eNOS含量不变，iNOS活性增高。本实验通过PM2.5水溶成分、脂溶成分和混合成分连续10 d鼠尾静脉染毒后，与对照组相比，PM2.5各染毒组无明显加强KCl和U46619对肾动脉血管环的收缩反应，但减弱Ach对肾血管环的舒张作用；各染毒组血清NO含量，血清iNOS活性均显著增高，混合成分染毒组血清eNOS含量减少。Ach对肾血管环舒张是依赖内皮的，提示连续10 d染毒可能导致血管内皮功能受损。NO是血管系统重要的保护因子，其活性的下降是许多心血管疾病发生的最重要因素之一；但在某些情况下，NO又对人体有害。它本质上是一种自由基，在人体内的半衰期很短，产生后迅速与氧合血红蛋白、超氧阴离子(O2-)反应而失去生理活性，产生较强的细胞毒作用［7］，考虑血清NO含量，血清iNOS活性均显著增高的机制可能与氧化应激有关。

大气细颗粒物成分在体染毒减弱Ach对大鼠肾血管环的舒张作用，氧化应激可导致血管内皮功能紊乱，NOS/NO系表达异常是其可能的相关机制。

参考文献:

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［2］赵晓红，郭新彪，金昱，等.可吸入颗粒物PM10对细胞间隙连接通讯的抑制作用［Ｊ］.环境与职业医学，2003,20(2):83-86.

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作者简介：孙萌（1985―），女，现为山西医科大学2008级心血管内科硕士研究生（邮编：030001）；吕吉元（通讯作者）、张涌,工作于山西医科大学（邮编：030001）；张明升,工作于山西医科大学药理教研室；庞卫乾，现为山西医科大学2010级在读硕士研究生。

（收稿日期：2011-03-01）