杜仲对UVA致HaCaT细胞光老化保护作用的实验研究

[摘要]目的:研究杜仲不同提取部位抗UVA致HaCaT细胞光老化的作用,并初步探讨其作用机制。方法:杜仲乙醇提取物经大孔树脂制备不同浓度乙醇梯度洗脱部位,分别作用于HaCaT细胞光老化模型,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法测定细胞活性,测定细胞培养液中LDH、MDA、SOD活力,确定并筛选杜仲抗皮肤光老化的作用及有效部位。结果:与模型组相比,浓度为1255μg/ml的50%乙醇大孔树脂洗脱部位能提高细胞活性(P

[关键词]杜仲;光老化;HaCaT细胞

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)09-1316-03

Protective effects of UVA induced photoaging in HaCaT cell by Eucommia ulmoides

LI Jian-min,XU Yan-ming,CHEN Qiao-yun,QI Yong-hua,ZHANG Ning

(School of Jiamusi,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo research the resistance effects to ultraviolet radiation induced photoaging in HaCaT cell by different extract fractions from Eucommia ulmoides, and preliminarily discuss its functional mechanisms.MethodsEthanol extract of Eucommia macroporous resin were prepared by different parts of the concentration gradient of ethanol. Cell morphous was observed by inverted microscope; cell activeness was measured by MTT; values of LDH, MDA and SOD in culture solution were detected. And finally the anti-photoaging constitutes of Eucommia ulmoides were screened and confirmed.ResultsCompared to model group, 50% elution site (the concentration of 1255μg/ml) could enhance cell activeness (P

Key words: Eucommia ulmoides;photoaging;HaCaT cell

皮肤光老化是指由于长期的日光照射导致皮肤加速衰老的现象,日光中的紫外线(UV,主要为UVA和UVB)是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。现代研究发现,杜仲具有促进胶原合成、抗衰老的作用,这些作用可能与杜仲的抗氧化活性有关[2]。本课题组前期工作表明,杜仲大孔树脂富集物能够抵抗UVB辐射引起的细胞氧化损伤,具有抗皮肤光老化的潜力。近年来,研究发现UVA剧烈照射与UVB一样,也能产生红斑和血管损伤,甚至引起的改变比UVB更为严重,只是产生这种效应所需的剂量较UVB大1000倍,可见,UVA在皮肤光老化发病中同样起着重要作用。因此,本课题组在前期工作的基础上,对杜仲抗UVA致HaCaT细胞光老化作用进行研究,更加全面评价杜仲抗皮肤光老化的作用。

1材料和方法

1.1材料:人表皮角质形成细胞HaCaT(武汉大学中国典型培养物保藏中心),MEM培养液(Gibco公司),胎牛血清(Sigma公司),乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、丙二醛测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2仪器:UVA紫外光疗仪(Sigma公司),离心机(上海安亭科学仪器厂),酶标仪(上海热电仪器有限公司),Olympus倒置显微镜(日本Olympus株式会社),生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),小容量恒温培养振荡器(上海智城分析仪器有公司),半自动生化分析仪(四川美生科技有限公司)。

1.3 细胞光老化模型的建立:将处于对数生长期的HaCaT细胞接种于96孔板,待细胞单层贴壁后,弃培养液,每孔加入150μl PBS,进行UVA照射,剂量为30J/cm2,空白组用铝箔盖住[3-5]。按公式1[6]计算紫外线的照射剂量,照射强度通过紫外线辐照计测量来测定。

照射剂量(J/cm2)=照射强度(W/cm2)×照射时间(s)……公式1

1.4 药物的制备:取杜仲70%乙醇提取浓缩制得的浸膏,上D101大孔吸附树脂,经乙醇梯度洗脱得到水洗脱部位、50%洗脱部位,冷冻干燥后用MEM完全培养液溶解,配制成浓度为1μg/ml的药液,调节pH值至7.0,0.22μm孔径滤膜过滤除菌,4℃保存,备用。临用时以MEM完全培养液稀释成实验所需浓度,浓度由预实验确定。

1.5分组及给药:将对数期HaCaT细胞接种于96孔板,37℃、5%CO2培养箱培养,待细胞贴壁后,分为空白对照组、模型组、给药组,各组细胞均设6个复孔。空白对照组:HaCaT细胞给予不含药MEM完全培养液,培养48h;模型组:HaCaT细胞培养24h,30J/cm2的UVA照射后,给予不含药的MEM完全培养液培养24h;给药组:HaCaT细胞培养24h,30J/cm2的UVA照射后分别给予500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml 4个浓度不同药物的MEM完全培养液,培养24h。

1.6指标观测

1.6.1细胞形态:用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化。

1.6.2细胞活性:向每孔(含100μl培养液)加入20μl浓度为5μg/ml的MTT,孵育4h,弃上清,加入150μl DMSO,置恒温培养振荡器内振荡10min,酶标仪测定各孔在492nm处吸光值(OD值)。按公式2计算细胞活性。

细胞活性=OD实验组/OD对照组×100%……公式2

1.6.3 LDH、SOD、MDA测定:按LDH、SOD、MDA测定试剂盒说明进行检测。

1.7统计处理:由SPSS 13.0软件完成数据分析。

2结果

2.1 对细胞形态的影响:倒置显微镜可观察到空白对照组细胞形态一致,边界清楚,排列紧密。模型组细胞数减少,细胞贴壁性降低,细胞间隙增大,细胞变圆或不规则,细胞体积变小,部分细胞裂解成细胞碎片,并有大量漂浮细胞。与模型组相比,125μg/ml的50%乙醇大孔树脂洗脱部位给药组细胞形态未发生明显改变。见图1。

2.2 对细胞活性的影响:结果见表1,与空白对照组相比,模型组细胞活性显著降低,二者具有显著性差异(P

2.3 对细胞培养液中LDH活力的影响:结果见表2,与空白对照组相比,模型组细胞培养液中LDH活力显著升高(P

2.4 对细胞培养液中SOD、MDA活力的影响:结果见表2,与空白对照组相比,模型组细胞培养液中SOD活力明显降低(P

以上结果表明,50%乙醇大孔树脂洗脱部位能提高细胞活性(P

3讨论

本实验结果显示,杜仲50%乙醇大孔树脂洗脱部位可通过提高SOD活力,加速氧自由基的清除和减少氧自由基的产生,使UVA所致的HaCaT细胞的脂质过氧化损伤程度得以降低。同时,50%乙醇大孔树脂洗脱部位可以降低UVA作用的HaCaT细胞LDH活力,减轻其所致细胞的不可逆损害。其机制可能是杜仲通过抗氧化作用,维持了细胞膜结构和功能的完整性,LDH的漏出减少;至于杜仲是否有直接地抑制LDH合成或加速LDH代谢的作用尚待进一步的研究。水洗脱部位仅对细胞培养液中LDH活力有一定作用,暂时不对其进行深入研究。

任何化学物达到一定浓度时均可引起器官、组织或细胞损伤。预实验中发现500μg/ml的给药剂量为毒性剂量,故我们选择了该范围内的4个浓度(500、250、125、62.5μg/ml)进行研究。

结合本课题组前期研究结果,发现杜仲50%乙醇大孔树脂洗脱部位对UVA和UVB[7]致HaCaT细胞光老化均有良好的保护作用,可以确定50%乙醇大孔树脂洗脱部位是抗皮肤光老化的有效部位。但50%乙醇大孔树脂洗脱部位仍是一个复合物,其抗皮肤光老化活性成分仍不清楚。在本研究结果的基础上,可以利用HaCaT细胞进行体外生物活性指导下的有效成分的分离分析,使确定50%乙醇大孔树脂洗脱部位中的有效单体结构以及后续结构改造成为可能。50%乙醇大孔树脂洗脱部位抗皮肤光老化的成分、分子机制等有待进一步研究。本研究为杜仲抗衰防皱功效型产品的研制以及我国杜仲资源的二次开发奠定基础,为中药抗皮肤光老化的现代研究提供方法学借鉴。

[参考文献]

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[收稿日期]2010-06-06[修回日期]2010-08-20