不同年龄段H型高血压合并慢性心力衰竭患者血清Hcy合成相关酶MTHFR、CBS及MTR表达研究

[摘要] 目的 研究不同年龄段H型高血压合并慢性心力衰竭患者血液中同型半胱氨酸（Hcy）合成关键酶甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、胱硫醚合成酶（CBS）和蛋氨酸合成酶（MTR）的表达特点。 方法 2012年1月～2013年9月云南省第三人民医院心内科收治H型高血压合并慢性心衰患者64例，根据年龄分为三组：70岁为D组（13例）；另选取30例体检健康人为正常对照组（A组）。采用ELISA测定炎性因子、总抗氧化能力（T-AOC）和同型半胱氨酸（Hcy）含量，Western blot及RT-PCR半定量检测全血中MTHFR、CBS和MTR mRNA及蛋白表达水平。 结果 B组、C组及D组患者的血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）、内皮素-1（ET-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、丙二醛（MDA）和Hcy明显高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B组、C组以及D组的T-AOC、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）明显低于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；RT-PCR以及Western blot结果显示：B组、C组及D组患者血清中MTHFR、MTR表达明显低于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B组与C组的CBS表达相较A组降低，但差异无统计学意义（P > 0.05），D组CBS表达明显低于A组，差异有统计学意义（P < 0.05），D组MTHFR、MTR、CBS表达均明显低于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 H型高血压合并慢性心衰患者血清中Hcy含量与年龄有关，这可能是Hcy合成相关酶MTHFR及MTR表达水平降低造成。

[关键词] 慢性心力衰竭；同型半胱氨酸；亚甲基四氢叶酸还原酶；胱硫醚合成酶；蛋氨酸合成酶

[中图分类号] R541.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）04（b）-0060-04

[Abstract] Objective To study the expression of serum Hcy synthesis key enzyme MTHFR， CBS and MTR in H-type hypertension patients with chronic heart failure. Methods From January 2012 to September 2013， in the Third People's Hospital of Yunnan Province， 64 H-type hypertension patients with chronic heart failure were selected， According to the patient's ages， they were divided into three groups， < 50 years were as group B （7 cases）， 50-70 years were as group C （44 cases）， > 70 years were as group D （13 cases） over， 30 healthy people in physical examination were selected as group A. The expression of inflammatory cytokines， total antioxidant capacity were detected by Elisa， mRNA and protein of MTHFR， CBS and MTR were detected by Western blot and RT-PCR. Results The levels of Ang Ⅱ， ET-1， TNF-α， IL-1β， MDA and Hcy in group B， group C and group D were significantly higher than those in group A， the differences were statistically significant （P < 0.05）； The levels of T-AOC， SOD， GSH in B group， group C and D groups were significantly lower than those in group A， the differences were statistically significant （P < 0.05）； MTHFR and MTR mRNA and protein expression in group B， group C and group D were significantly lower than those in group A， the differences were statistically significant （P < 0.05）， CBS expression in group D was significantly lower than that in group A， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The level of serum Hcy in H-type hypertension in patients with chronic heart failure is relevant with age， which maybe due to Hcy synthesis enzymes MTHFR and MTR lower expression caused.

[Key words] Chronic heart failure； Hcy； MTHFR； CBS； MTR

心力衰竭（简称“心衰”）临床中又称之为心功能不全[1]，主要是指血液静脉回流时，心脏由于一些已知或未知的原因导致其收缩和/或舒张功能发生障碍，收缩或舒张功能的障碍可导致其心排血量不足，排血量的不足又会导致身体代谢能量供应不足，最终造成了本病发生与发展[2]。H型高血压合并心衰是指伴有高同型半胱氨酸血症的原发性高血压病患者同时合并慢性心衰的症状[3]，近年研究表明，H型高血压可通过规范降压治疗及补充叶酸和维生素B12降低高同型半胱氨酸从而改善预后[4]，但是研究[5]也发现有些患者通过上述治疗效果并不理想，本文通过研究不同年龄段H型高血压合并慢性心衰患者血液中同型半胱氨酸（Hcy）合成关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、胱硫醚合成酶（CBS）以及蛋氨酸合成酶（MTR）的表达特点，为本病的针对性治疗提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年1月～2013年9月云南省第三人民医院心内科住院并确诊H型高血压合并慢性心衰患者64例，其中男30例，女34例，年龄21～87岁，平均（54±10）岁；64例患者按年龄分为三组：70岁为D组（13例）。所有患者心功能按纽约心功能分级均为Ⅱ～Ⅳ级，同时其均伴有高同型半胱氨酸血症（Hcy≥14 μmol/L），有明确高血压病史（既往不同时间规范测血压超过3次舒张压≥90 mmHg和/或收缩压>140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），且高血压病史>5年。另选取30例体检健康人为正常对照组（A组），其中男16例，女14例，年龄31～84岁，平均（53±11）岁，A组均排除相关心脑血管疾病，且血清Hcy含量均在正常范围。

1. 2 方法

1.2.1 试剂盒及仪器 血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）和内皮素-1（ET-1）检测试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）及白介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒购于上海信裕生物科技有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）试剂盒购于上海圻明生物科技有限公司；全血总RNA提取试剂盒购于上海研卉生物科技公司；兔抗鼠多克隆抗体MTHFR、CBS、MTR购于Abcam公司、ECL发光试剂盒以及单克隆抗体β-actin购于Santa Cruz公司，二抗购于武汉博士德生物工程公司；总RNA提取试剂盒购自Sun ShineBio公司；引物由生工生物（上海）公司设计并制造。

1.2.2 标本采集 患者在采血前禁食高脂饮食24 h及禁大量补水，同时在12 h前禁食。患者采血时间均为早晨8∶00～10∶00，于静脉穿刺抽取5 mL，放入抗凝血血清管内密封备用。另抽取3 mL血清立即行低温离心（4000 r/min），10 min，提取上清液放入-80℃冰箱保存，待后期血液全部收集完后统一检测。

1.2.3 RT-PCR检测mRNA的表达 取患者全血，用全血总RNA提取试剂盒提取总RNA并定量，之后每组各取2 μg总RNA逆转录cDNA。（MTHFR引物为：PrimerA：5'-GAGCCAGCGGAA AAGAAGT-3'，PrimerB：5'-GTAGTCTGGTTTAGCCAGTG-3'；产物长度为554。CBS引物设计为：PrimerA：5'-GCGGTATTCACTGTCGACCTA-3'，PrimerB：5'-GGTGGTA TGGTGTAAGGCTA-3'；产物长度为417；MTR引物设计为：PrimerA：5'-CCCTGGCGGTGA ATTTGCT-3'，PrimerB：5'-ACTTGACTGCGAGTCCCAAC-3'产物长度为443；β-actin引物设计为：PrimerA：5'GGCCGCGCCCGCAACCA-3'，PrimerB：5'ACGCAGCTCATGTGTAAGTAGGTG G-3'，产物长度为537 bp）。PCR扩增条件为：98℃ 2 min，98℃ 10 s、48℃ 30 s、72℃ 35 s，循环次数33次；最后再延伸5 min。PCR反应产物在含核酸染料的1.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳完成后采集图像，计算各条带的荧光强度值，每组实验重复3次。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达 用超声细胞破碎仪匀浆，BCA法测定蛋白含量并定量，之后取样本80 μg电泳，电泳结束后切取目标蛋白转移至PVDF膜，之后加入5%的脱脂牛奶封闭2 h，倒出牛奶加入一抗，4℃过夜，洗膜后二抗孵育，洗涤后与ECL发光试剂反应，曝光洗片，扫描图像后计算各条带的灰度值，每组实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清炎症因子

B组、C组和D组患者的AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β明显高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；同时B组、C组及D组有逐步增加的趋势。此外，C组TNF-α以及IL-1β含量明显高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）；D组AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β均明显高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。2.2 血清氧化和抗氧化能力

B组、C组以及D组的T-AOC、SOD以及GSH明显低于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B组、C组以及D组的MDA明显高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 血清中总Hcy

B组Hcy水平为（16.58±4.36）μmol/L、C组为（17.23±7.14）μmol/L、D组为（19.26±9.24）μmol/L，均明显高于A组（13.28±3.66）μmol/L，差异有统计学意义（P < 0.05）。B、C以及D组有逐步增加的趋势，且D组明显高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.4 MTHFR、CBS、MTR的mRNA表达

RT-PCR结果显示：与A组比较，B组、C组、D组的MTHFR、MTR mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；但B组和C组CBS表达与A组比较，无统计学意义（P > 0.05），D组与A组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；D组MTHFR、CBS、MTR表达明显高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1、表3。

2.5 MTHFR、CBS、MTR的蛋白表达

Western blot结果显示：与A组比较，B组、C组以及D组的MTHFR以及MTR mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；但B组和C组的CBS表达与A组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），D组与A组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）； D组MTHFR、CBS、MTR表达明显高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表4。

3 讨论

当前H型高血压合并慢性心衰发病率逐年升高，有调查发现全球心衰患者高达2250万例，且以每年200万例的速度递增[6]。我国属于慢性心衰的高发区，患者高达1300万例，心力衰竭患者2年死亡率高达37%，6年死亡率达到82%，死亡率高于许多恶性肿瘤[7]。此病在成年人群中的发病率为1.3%～5.6%，并随着年龄的增高而上升，在65岁以上人群中，发病率为7.4%，80岁以上发病率则高达10%[8]。数据表明，心衰已经成为威胁我国人民健康的一大疾病，因此如何阻止或延缓心衰的发生，降低本病的死亡率仍是困扰医学界的一大难题[9]。

Hcy相关酶主要表达于肝脏，可出现于全血，其转化的分子机制有两条路径，路径一为在MTHFR的催化下，四氢叶酸可发生甲基化进而生成N5-甲基四氢叶酸，N5-甲基四氢叶酸可在MTR的催化下作为供体给Hcy提供甲基，最终促进Hcy合成蛋氨酸；第二条途径为Hcy在CBS的催化下，与血清中游离的丝氨酸缩合生成胱硫醚，胱硫醚再进一步转化为其他物质，最终经尿排出体外[9-12]。近年来Hcy与心衰的关系受到了越来越多学者的关注，有研究显示Hcy的高水平表达可导致的血管内皮的损伤，从而造成炎症因子AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β等的过量释放，进而造成机体氧化和抗氧化能力的失衡[13-14]。

本次研究结果显示：H型高血压合并慢性心衰患者其血清中Hcy均处于高表达状态，同时不同年龄段比较， B组、C组和D组AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β 4种炎性因子明显高于A组（P < 0.05）； B组、C组以及D组氧化和抗氧化能力明显低于A组（P < 0.05），B组、C组和D组MDA明显高于A组（P < 0.05），提示：H型高血压合并慢性心衰患者其体内的炎性反应及氧化能力随着年龄的增加而增加。另外C组以及D组患者血清中MTHFR、CBS以及MTR mRNA及蛋白表达明显低于A组（P < 0.05），CBS表达B组与C组相较于A组有一定的降低，差异无统计学意义（P > 0.05），D组则明显低于A组（P < 0.05），提示：随着年龄的增加，H型高血压合并慢性心衰患者MTHFR、CBS以及MTR均发生了一定的异常，但MTHFR以及MTRB异常程度要大，CBS异常主要发生于70岁以上老年人。

综上所述，H型高血压合并慢性心衰患者血清中Hcy含量随着患者年龄增大而升高，临床中辅助治疗通过补充叶酸和维生素B12[15-16]可有效改善Hcy合成相关酶MTHFR以及MTR表达水平，进而降低叶酸水平，但70岁以上老年人CBS表达较低不易通过补充叶酸和维生素B12改善，今后应引起医师的注意。

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（收稿日期：2016-01-15 本文编辑：苏 畅）