磺酸基修饰SBA―15在MALDI―TOF―MS氨基酸分析中的应用

摘 要：磺酸基化学修饰的介孔材料sba-15被用做无机基质，用于maldi-tof-ms分析几种人体必需氨基酸。在优化的分析条件下，磺酸基修饰的SBA-15对氨基酸的检出限达到pmol级别。混合氨基酸样品被成功检测。

关键词：SBA-15；MALDI-TOF-MS；必需氨基酸

基质辅助激光解吸电离技术MALDI，是21世纪80年展起来的一种应用于质谱分析的电离化技术。它被成功应用于生物大分子的分析领域。然而由于使用了有机基质，在小分子量区域产生了碎片干扰。为了解决这一问题，质谱学界做了大量的尝试和研究[1]。近年来出现了一些将表面化学修饰的介孔材料SBA-15用于MALDI无机基质的报道[2]。

氨基酸是重要的生物小分子，其中8种必需氨基酸，是一些疾病的标志物，对它们的分析检测具有很大的应用价值[3]。MALDI-TOF-MS分析具有简单、快速的优点。本研究拟采用磺酸基修饰的SBA-15，用作无机基质，分析几种必须氨基酸。

实验部分

1 仪器与试剂

MALDI-TOF-MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（岛津公司）；三氟乙酸，3-巯基丙基三甲氧基硅烷，溶剂，氨基酸（分析纯，希恩思公司）；SBA-15（南京先锋纳米科技公司）。

2 SBA-15的化学修饰

SBA-15，在马弗炉中550℃下焙烧2h，接着与3倍质量的MPTMS，在精制甲苯中回流48h。过滤，用乙醇索氏提取24h。真空干燥24h，得到SBA-15-SH。称量100mg的SBA-15-SH，加入10mL质量比为1/3/10的双氧水、甲醇和水溶液中，室温下搅拌12h，过滤。滤饼加入到5mL 0.5mol/L的H2SO4溶液中，室温下搅拌12h，过滤。用乙醇和水洗涤，抽滤，得到SBA-15-SO3H[3]。真空干燥12h，取出，置于干燥器中保存。

用FT-IR进行定性分析。FT-IR结果表明，在嫁接巯基后，在2850～2980cm-1范围内出现其伸缩振动峰。同时，在2580cm-1处出现一个弱的S-H吸收峰。磺化后，2580cm-1处的吸收峰消失。

3 分析条件的优化

3.1 基质，样品，与酸比例的优化

将苯丙氨酸，缬氨酸，TFA配制成3*10-4mol/L的甲醇溶液。将SBA-15-SO3H配制成0.06、0.6、6mg/mL的甲醇分散液。样品/酸/基质各取5μL混合，震荡。从中移取1μL，点样。自然干燥后，进入MADLI-TOF-MS进行分析。谱条件为：正离子反射模式，能量120，100个信号累加。在10-4mol/L浓度下，缬氨酸与苯丙氨酸都能够很好的被检测到。我们考察了在样品与酸的浓度一定时，基质的量对信号强度的影响，实验结果如下：Phe，磺化SBA-15的ρ=0.02mg/mL，信号强度为5.5K；ρ=0.2mg/mL，强度为11K；ρ=2mg/mL，强度为11.5K。Val，ρ=0.02mg/mL，强度为3K；ρ=0.2mg/mL，强度为6K；ρ=2mg/mL，强度为6.5K。可见，样品一定，SBA-15-SO3H的量的增加使信号强度增加。但当基质浓度达到0.2mg/mL以后，增加的较不明显，考虑到随着SBA-15-SO3H的量的增加，可能会带来少量的碎片的干扰。我们最终选择比例为10-4mol氨基酸/0.2g磺基化SBA-15。

此外，我们考察了酸的浓度对信号强度的影响，经过类似的信号强度对比试验，我们最终选择了10-3mol/L为优化的条件，即三氟乙酸的浓度为样品的10倍。

3.2 溶剂的优化

MALDI-TOF-MS分析存在一个问题，就是重现性较差，而这与溶剂的分散能力有关。所以我们考察了三种常用的溶剂，甲醇，乙腈，水。将苯丙氨酸，缬氨酸分别配制成3*10-4mol/L的甲醇，乙腈，水溶液。在优化比例下进行分析，质谱条件同上。每个样品要点样三次，每个样品点分析两次。分析后计算RSD值/%如下：Phe/甲醇，29；Phe/乙腈，27；Phe/水，21；Val/甲醇，31；Val/乙腈，26；Val/水，18。水中的重现性最好，这可能是由于磺化的SBA-15在水中的分散能力提高造成的。

4 检出限的研究

将苯丙氨酸，缬氨酸，分别配制成3*10-4、3*10-5、3*10-6、3*10-7mol/L的水溶液。优化条件下，进入MADLI-TOF-MS进行分析。当样品浓度为10-6mol/L时，以SBA-15-SO3H为基质能够顺利检出，[Val+Na]+、[Phe+H]+的S/N分别为32，53。

图1 pmol样品的MALDI-TOF-MS谱图。质谱条件同上。a）缬氨酸，b）苯丙氨酸。

5 混合样品的分析

将5种氨基酸，配制成浓度均为10-4Mmol/L的混合水溶液。在优化条件下，进入MADLI-TOF-MS进行分析。结果如图2，得到了各自区分的信号。

图2混合样品的MALDI-TOF-MS谱图。m/z：缬氨酸117，苏氨酸119，异亮氨酸131，甲硫氨酸149，苯丙氨酸165。

6 结束语

本研究将磺酸基化学修饰的SBA-15，用作MALDI-TOF-MS的无机基质，分析了几种人体必需氨基酸。我们优化了分析条件，并实现了对混合样品的分析。由于磺酸基的存在，修饰的SBA-15作为基质的检出限得到了降低，并且在水做溶剂的条件下，具有较好的重现性，适用于对生物小分子进行分析。

参考文献

[1]张森，倪 ，李树奇，孔祥蕾.适用小分子化合物分析的基质研究[J].化学进展，2014，26（1）：158-166.

[2]王小生.必需氨基酸对人体健康的影响[J].中国食物与营养，2005，7：48-49.

[3]袁兴东，沈健，李国辉，周敬来，金知晚，朴尚颜.表面含磺酸基的介孔分子筛催化剂SBA-15-SO3H的制备及其催化性能[J].高等学校化学学报，2002，23（12）：2332-2335.