巴戟天醇提物对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

[摘要] 目的 探讨巴戟天醇提物对肾缺血再灌注损伤（IRI）的保护作用。 方法 将80只健康雄性Wistar大鼠随机均分为假手术组、IRI模型组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组4组，每组各20只。巴戟天高、低剂量组大鼠均连续灌胃给予一定浓度的巴戟天醇提物，而假手术组和IRI模型组大鼠仅给予生理盐水灌胃，用药7 d后，建立肾IRI模型。采用生物化学法检测血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平以及肾组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）水平，采用TUNEL法检测肾组织细胞凋亡情况。 结果 与IRI模型组相比，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组血清BUN、Cr水平降低（P < 0.05）；巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组肾组织中SOD、GSH-Px水平升高，而MDA水平降低（P < 0.05）；巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组凋亡指数降低（P < 0.05）。巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组血清BUN、Cr水平，肾组织中SOD、GSH-Px水平，凋亡指数比较差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 巴戟天醇提物能够保护肾IRI后的肾组织，这可能与其具有抗氧化和抗凋亡作用有关。

[关键词] 巴戟天醇提物；肾；缺血再灌注损伤；尿素氮；肌酐；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；丙二醛；细胞凋亡

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（b）-0022-03

严重肾挫伤、复杂肾手术等处理过程中容易引发肾缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI），严重者可能会导致肾衰竭，因此，在进行肾手术治疗的同时，保护肾组织免受损伤成为了目前临床中的研究热点[1]。以往多采用缺血预适应的方法防治手术引发的肾IRI。近年来，随着减轻缺血再灌注损伤药物的研究进展，人们逐渐倾向于应用更为简单的药物预适应的方法防治IRI。双子叶植物茜草科植物巴戟天最早应用于阳痿、月经不调等疾病的治疗。研究表明，巴戟天醇提物能够保护IRI心肌组织，且能够延缓大鼠的衰老[2-3]。本研究旨在通过观察巴戟天醇提物对大鼠肾IRI后血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）水平、肾组织超氧化物歧化酶（superoxidase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，肾细胞凋亡情况的变化，进而探讨巴戟天醇提物对肾IRI的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

巴戟天醇提物提取自巴戟天（一等品，广东省德庆县药材公司，河南省食品药品检验所鉴定）；SOD、GSH-Px、MDA、考马斯亮兰蛋白测试盒（批号：20120312、20120317、20120314、20120319）均购自南京建成生物工程研究所；TUNEL法检测试剂盒（批号：14751125471）购自美国Roche公司；c8000全自动生化分析仪购自美国Abbott Laboratories公司；722型分光光度计购自上海第三分析仪器厂；Biofuge Stratos台式高速低温离心机（德国Heraeus公司）。

1.2 实验动物及分组

80只健康Wistar大鼠，雄性，6月龄，体重220～289 g，平均（245±25）g，购自河南省实验动物中心。将其随机均分为假手术组、IRI模型组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组4组，每组各20只。

1.3 给药方法

各组大鼠均正常饲养，巴戟天高、低剂量组大鼠均连续灌胃给予一定浓度的巴戟天醇提物3.0 g/（kg·d）、1.5 g/（kg·d），而假手术组和IRI模型组大鼠仅给予生理盐水灌胃，用药7 d后，建立肾IRI模型。肾IRI模型建立方法：大鼠禁食12 h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.2 μL/g）麻醉；常规消毒和术前准备；于下腹部正中做一长约2.5 cm的切口，进入腹腔，向上提起肾脏，并切除右侧肾脏；用无创小血管夹夹闭左侧肾动脉，使之缺血1 h，然后再复灌4 h，此时模型制作完毕。其中假手术组仅做腹部切口，游离双侧肾脏，分离双侧肾脏动脉。其余3组均按上述步骤制作肾IRI模型。

1.4 BUN、Cr、SOD、GSH-Px和MDA水平及肾脏组织病理变化的观察

灌流结束后，每组取10只大鼠，采集静脉血3 mL，4℃下以3 000 r/min离心15 min，检测BUN及Cr水平；然后将这10只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，取出左侧肾脏，称取100 mg用生理盐水制成匀浆，4℃下以3 000 r/min离心15 min，取适量上清液，检测SOD、GSH-Px和MDA水平，其中总蛋白检测采用考马斯亮兰法。上述操作严格按照试剂盒说明进行。

1.5 肾细胞凋亡的检测方法

灌流结束后，每组剩余10只大鼠取左侧肾脏，用40 g/L多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，最后制成4 μm切片。首先进行HE染色，观察肾脏组织的病理变化；然后进行TUNEL染色。TUNEL染色后，细胞核呈蓝色者为正常肾细胞；单个细胞，细胞周围未见炎症反应，包膜明显皱缩，细胞核致密深染呈棕黄色。低倍镜下选择阳性表达明显的区域，然后在400倍镜下选择5个视野计数凋亡细胞及总细胞数量，并按照公式[凋亡指数=总凋亡细胞数/总观察细胞数×100%]计算肾脏的凋亡指数。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，行正态性检验和方差齐性检验，符合两个条件者，采用单因素方差分析和LSD-t检验进行比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾缺血再灌注损伤后HE染色结果及血尿素氮、肌酐水平

HE染色结果显示：假手术组大鼠肾脏组织未见明显的异常；IRI模型组大鼠肾脏组织肾间质轻度水肿，血管明显扩张，炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、变性、坏死，少数管腔内可见蛋白管型和（或）少量红细胞；2个巴戟天组大鼠肾脏组织损伤均较IRI模型组明显减轻，其中巴戟天高剂量组减轻更明显。与IRI模型组相比，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组血清BUN、Cr水平降低（P < 0.05）；巴戟天低剂量组血清BUN、Cr水平高于巴戟天高剂量组（P < 0.05）。见表1。

2.2 肾缺血再灌注损伤后肾组织中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛水平

与IRI模型组比较，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组肾组织中SOD、GSH-Px水平升高，而MDA水平降低（P < 0.05）；巴戟天低剂量组SOD、GSH-Px水平低于巴戟天高剂量组，而MDA水平高于巴戟天高剂量组（P < 0.05）。见表2。

2.3 肾缺血再灌注损伤后凋亡指数

与IRI模型组比较，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组肾组织细胞凋亡指数降低（P < 0.05）；巴戟天低剂量组肾组织细胞凋亡指数高于巴戟天高剂量组（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

肾IRI是一种过程复杂、影响因素众多的病理生理学过程，严重者可导致肾缺血衰竭等严重并发症的发生，另外IRI的发生也是肾移植手术失败的主要原因之一。大量研究表明，肾IRI的形成可能与自由基过剩、细胞凋亡、细胞内钙超载、炎症反应等有关[4-5]。当体内自由基过剩时，就会对机体产生负性影响，造成机体生物膜的损伤，生成大量的MDA等过氧化脂质体，而MDA不仅是过氧化反应的产物，其本身也会进一步加重机体的损伤，MDA的体内水平在一定程度上反映了机体过氧化的程度以及肾组织受损程度[6]。SOD及GSH-Px均是体内重要的抗氧化酶，能够清除体内过剩的自由基，两者的体内水平一定程度上反映了机体的清除自由基的能力[2，7-8]。肾IRI情况较重时肾组织会出现器质性病变，例如线粒体膜损伤、细胞凋亡、细胞坏死等[9-10]。研究发现，肾IRI主要以肾小管细胞的凋亡和坏死为特征，且细胞的凋亡、坏死与早期肾组织内的自由基过剩以及机体清除自由基能力下降关系密切[11-12]。

本研究结果显示：肾IRI大鼠血清BUN、Cr水平均较假手术大鼠升高，且HE染色示大鼠肾组织有坏死变性情况的发生，而BUN水平升高提示肾小球过滤功能降低、Cr水平升高，HE染色示的变性坏死则提示肾实性组织发生损伤，因此这提示肾IRI大鼠肾组织损伤严重，提示造模型成功；而应用巴戟天醇提物的大鼠BUN及Cr水平低于肾IRI大鼠，且HE染色结果示肾组织变性坏死程度减轻，说明巴戟天醇提物能够保护IRI肾组织，另外巴戟天醇提物两个剂量组的BUN、Cr水平差异还提示其抗肾IRI作用具有一定的剂量依赖性。本研究结果还显示：IRI大鼠的肾组织SOD、GSH-Px水平低于假手术大鼠，而MDA水平高于假手术大鼠，进一步验证了肾IRI发生的自由基学说；与IRI大鼠相比，巴戟天醇提物两个剂量组大鼠肾组织中SOD、GSH-Px水平升高，而MDA水平降低，且两个剂量组的3种因子水平有差异，提示巴戟天醇提物的抗肾IRI作用可能与其具有剂量依赖性的抗氧化作用有关。本研究关于肾IRI发生后细胞凋亡的研究发现，IRI大鼠的肾组织细胞凋亡指数明显高于假手术大鼠，提示细胞凋亡的发生是IRI形成的病理基础；与IRI大鼠相比，巴戟天醇提物两个剂量组大鼠肾组织凋亡指数降低，且两个剂量组凋亡指数有差异，提示巴戟天醇提物能够通过其具有剂量依赖性的抗细胞凋亡作用减轻肾IRI。

综上所述，巴戟天醇提物能够保护肾IRI后的肾组织，这可能与其具有抗氧化和抗凋亡作用有关。

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（收稿日期：2012-09-17 本文编辑：谷俊英）